可还原降解高分子接枝PEI作为基因载体的研究

高效、安全地将外源基因递送到细胞内部并高效表达的基因传递系统是基因治疗中的关键因素。本项目利用可还原降解高分子偶联低分子量PEI，合成还原降解型聚阳离子，构建非病毒基因传递系统，通过对其理化性质、复合稳定性，还原降解性，以及对不同细胞系的转染实验，研究高分子结构对基因传递系统的影响，并利用半乳糖修饰还原降解型聚阳离子，构建对肝癌细胞具有靶向性能的基因传递系统，研究其对不同肿瘤细胞的摄入、细胞内转运、基因表达的影响，利用p53缺失肝癌细胞株建立动物模型，研究复合p53质粒的基因传递系统对p53蛋白表达的作用及其抗肿瘤效果。这种还原降解型聚阳离子可利用疏水链段调节PEI的电荷强度，减小其毒性，且自身具有两亲性，可形成胶束状纳米粒子，与DNA稳定复合，并响应细胞内微环境而降解，使复合物能够根据需要释放基因，载体能够降解成为低毒性的小分子，可望成为获得安全可靠的高转染效率非病毒载体的有效途径。

近年来基因治疗被视为治疗某些重大遗传疾病和肿瘤等许多疾病的最有希望的手段之一。由于细胞外和细胞内的多重阻碍的存在，能够将外源基因递送到细胞内部得以表达，就需要一个安全高效的基因传递系统。PEI作为基因载体具有制备简单，缓冲能力强，转染效率高等优点，但是其生物毒性较强的缺点比较明显，尤其是通过增加PEI的分子量来提高其转染效率的同时也在不断的提高着载体的生物毒性。因此如何在保证PEI较高的转染效率的情况下最大可能的降低载体的生物毒性就成为近年来改性PEI作为基因载体研究的热点。本研究通过双丙烯酰化胱氨酸与苯乙胺进行聚合，得到能够在还原环境下降解的疏水性主链（聚酰胺-胺，PAA），再在主链上接枝上亲水性的低分子量的PEI，来作为一种新型的基因载体。由于载体的两亲性，在水溶液中可自组装为较为稳定的纳米颗粒，这种纳米颗粒的内核为可还原降解的疏水主链，外壳为亲水的低分子量PEI。这种载体不但结构稳定，保证了载体的正电荷密度，能够较好的复合质粒DNA，达到较高的转染效率，而且，可以在还原条件下降解为低分子物质，极大程度的降低了载体的毒性，还能够使质粒DNA更加高效的从复合物中释放出来，更加有利于转染的进行。本研究中利用核磁和元素分析对载体（PAA-PEI）进行结构表征，用酸滴定的方法测试了载体的缓冲能力，利用凝胶电泳对载体复合质粒DNA的能力，对DNA的保护能力以及能否释放DNA进行了测试，通过DLS测定了不同N/P条件下载体与DNA形成复合物的纳米粒径和Zeta电位，通过MTT法测试了载体在L929和HEK293两种细胞中的细胞毒性，利用绿荧光蛋白基因进行转染实验，通过流式细胞仪对转染效率进行定量测定。一系列的实验证明相较于PEI25K，PAA-PEI2000作为基因载体具有较低的细胞毒性，以及更高的转染效率。在此基础之上，本项目进一步研发了叶酸分子、普鲁兰多糖分子和聚精氨酸分子修饰的主动靶向型和被动靶向增强型抗肿瘤药物载体材料。实验结果发现，叶酸分子靶向的药物载体比非靶向的药物载体具有更好的抗肿瘤效果。普鲁兰多糖分子修饰的纳米粒子能够选择性地靶向肝肿瘤细胞，在细胞内酸性条件下有效传递药物到细胞核。聚精氨酸分子增强型的载药胶束比非靶向的药物载体更好的促进药物在肿瘤部位的有效聚集。