三湖红橘ClWRKY57参与ABA信号转导途径及其抗旱功能研究

Drought is one of the key abiotic stresses affecting the citrus industry of Jiangxi province, making drought-tolerant germplasm breeding an important goal for citrus. ‘Sanhu’ Red Mandarin is a local citrus germplasm. References and our previous results demonstrated that it has great potential in drought tolerance, but the underlying mechanism is still not clear. Therefore, drought–treated ‘Sanhu’ Red Mandarin leaves were subjected to mRNA transcriptome sequencing. Data mining revealed a WRKY gene, the ORF of which was cloned and named as ClWRKY57. Meanwhile, we found that plenty of W-box cis-elements existed in the promoters of ClNCED1, ClABF and ClICE1, indicating that ClWRKY57 might participate in ABA signal transduction pathway via transcriptional regulation of these ABA-related genes. Hence, the identification of ClWRKY57 as an important transcription factor in ABA signal transduction pathway makes one of our goals. The other goal of our project is the functional characterization of ClWRKY57 via the creation of overexpression and RNAi transgenic plants. Taken together, this project is the further study of the previous work, and it will provide a candidate gene for drought tolerance in genetic modification of citrus as well as the utilization of local citrus germplasm.

干旱是影响江西省柑橘生产的重要非生物胁迫之一, 培育抗旱新种质是我省柑橘遗传育种的一个重要目标。三湖红橘（Citrus reticulata）是江西地方特色柑橘资源，文献报道及本项目前期研究发现它具有较大的抗旱种质资源开发与应用潜能，但其抗旱机理尚不明晰。于是本课题组将干旱处理的三湖红橘进行了转录组测序分析，根据基因注释和文献参考从中筛选了一个基因，命名为ClWRKY57。同时，前期克隆的ClNCED1、ClABF、ClICE1启动子序列都存在多处可与WRKY结合的W-box，说明ClWRKY57可能通过对这些基因的转录调控参与ABA信号转导途径。本项目拟先鉴定ClWRKY57是ABA信号转导途径应答干旱胁迫的重要转录因子，然后通过超表达和RNAi技术验证其抗旱功能。本项目为原有研究的深入，其开展既为柑橘抗逆遗传改良提供具有自主知识产权的基因资源，又有助于地方优异特色种质资源的开发和利用。

干旱是限制柑橘产业发展的主要非生物胁迫之一。通过基因工程可以对作物进行定向的遗传改良，但从抗性材料中发掘和鉴定抗逆基因是利用基因工程创制遗传改良植株的前提和关键。. 三湖红橘（Citrus reticulata）为江西省古老栽培品种，前期研究证明其抗旱性极强。WRKY是ABA响应信号网络中承上启下的一个关键节点，在植物的生长发育和抗逆过程中都发挥着极其重要的调控作用。本项目通过分析干旱前后三湖红橘的RNA-seq数据，筛选并克隆了一个WRKY57基因，研究了其是否参与ABA信号转导及抗旱功能。具体研究内容包括：①三湖红橘干旱胁迫转录组数据分析及目标抗旱基因筛选；②CrWRKY57的分离及转录因子特性鉴定；③CrWRKY57与ABA信号转导途径重要基因的互作分析；④CrWRKY57抗旱功能验证。重要结果如下：. 1. RNA-seq共筛选到14082个差异表达基因（DEGs）。14个DEGs表达量的qRT- PCR与RNA-Seq结果相关系数高，证明转录组数据可靠。GO注释和KEGG分析结果表明，筛选的DEGs参与多个代谢途径，说明三湖红橘在转录组水平积极响应干旱胁迫。挖掘到803个干旱响应转录因子。后续筛选了WKRY57作为目的基因进行研究。. 2. 利用同源序列法克隆了CrWRKY57 ORF全长，编码292个氨基酸，分子量为32.05 kDa，理论等电点为6.19，属于WRKY家族 IIc亚族，是一个定位于细胞核但无自激活活性的转录因子。. 3. 双分子荧光互补实验证明CrWRKY57可与CrABF蛋白互作，酵母单杂交结果表明其还可转录调控CrABF、CrICE、CrNCED，从而参与ABA信号转导。RNAi三湖红橘叶片ABA含量降低，说明CrWRKY57是ABA途径的正调控因子。. 4. 通过对CrWRKY57超表达系和RNAi系的干旱表型和生理指标测定，证明其具有抗旱功能。叶片显微结构观察发现超表达系气孔密度变大，而RNAi系气孔密度和叶肉栅栏组织厚度变小，同时RNAi系中FAMA、ICE等气孔发育相关基因的转录水平显著下降，说明CrWRKY57可通过调控叶片结构和气孔发育以增强植株的抗旱性。. 本项目阐明了CrWRKY57应答干旱胁迫的转录机制，为柑橘抗旱遗传改良提供了具有自主知识产权的基因资源。