非吸烟肺癌表皮生长因子受体基因相关非编码小RNA差异表达研究

针对非吸烟肺癌发病率不断上升且发病机制不同于吸烟者患肺癌的状况，特别是东亚地区非吸烟肺癌患者表皮生长因子受体基因(EGFR)的高突变率特征,根据不同的肿瘤临床病理和预后特征具有显著差异的非编码小RNA(miRNAs)表达谱的假说，本项目将在前期已运用全基因组miRNAs芯片对肺癌组织进行667个人类miRNAs表达谱检测的基础上，采用TaqMan实时荧光定量PCR方法对筛选出的EGFR突变与野生组比较表达差异最大的10个miRNAs，在420例非吸烟肺癌患者的组织和血浆样本中逐一分别开展表达验证研究，最终获得EGFR突变相关miRNAs。一方面研究其与临床病理特征和预后的关系，拟合预测模型；另一方面进行miRNAs的体外实验，探索其与EGFR及下游靶基因之间的关系，对阐明EGFR突变的分子机制，揭示中国的高突变率特征具有重要意义，也为临床个体化分子靶向治疗筛选和预后判断提供参考。

本项目针对非吸烟肺癌发病率不断上升且发病机制不同于吸烟者患肺癌的状况，特别是东亚地区非吸烟肺癌患者表皮生长因子受体基因(EGFR)的高突变率特征,根据不同的肿瘤临床病理和预后特征具有显著差异的非编码小RNA(miRNAs)表达谱的假说，首先采用人的全基因组miRNAs芯片检测了患者手术新鲜组织样本和匹配的血浆样本中miRNAs表达情况，采用生物信息学分析筛选出包括EGFR突变/野生型等不同特征差异表达的miRNAs，然后通过TaqMan实时定量PCR的实验技术，在130例女性非吸烟肺癌队列的组织和匹配的血浆样本中对近50个miRNAs进行了逐一验证研究，开展临床关联分析。. 我们的结果发现miR-122在女性非吸烟患者EGFR突变型和野生型的血浆中存在明显的差异表达，而且血浆中一组miRNAs的表达状态与患者的临床特征以及预后密切相关，特别是在临床晚期以及EGFR突变检测为阳性的患者当中。经数学模型方程拟合，发现采用患者血浆miR-195联合miR-122和miR-143 判断EGFR突变的肺癌患者预后的灵敏度可达到70.7%。而对肺肿瘤组织样本的研究发现，其与血浆样本中miRNAs的表达不具有统计学相关性。检测的25个miRs在癌与癌旁组织中存在明显的差异表达，且大多数呈现癌组织中低表达状态。组织miR-25、miR-183-3p等的表达或与临床分期、淋巴结转移、远处转移以及预后、EGFR突变与否等都存在密切关系。. 本项研究亦重点对miR-195等开展了靶基因预测及体外细胞学研究。通过对5个肺癌细胞株体外培养，转染miR-195的模拟物和抑制子，采用MTT实验，细胞划痕、流式细胞分析、Luciferase报告基因实验及Western-blot等体外实验技术，我们发现miR-195可直接靶CHEK1基因的3‘UTR，下调其表达，并可能同时作用于细胞周期通路上CCND1，CCNE几个基因，在肺癌的发病和预后中共同发挥作用。此外，我们的研究也发现miR-23b可通过靶SET8基因抑制肺癌细胞生长增殖、迁移和侵袭，在肺癌的发生发展中可能起一定作用。