β-arrestin-2调控mGluR7受体信号在发育期七氟醚促神经元凋亡中的作用

It is well established that sevoflurane exposure could trigger wide neuronal apoptosis in the CNS (central nervous system) developmental scenario, and cause learning and memory disorders persistent to adult. However, the mechanism underlying this process remains to be elucidated. Our recent work demonstrated that activation of mGluR7 (metabotropic glutamate receptors 7) remarkably ameliorated the neuronal apoptosis induced by sevoflurane exposure in the developing brain. We also found that ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1 and 2) MAPK (mitogen-activated protein kinase) signaling plays a pivotal role in developmental sevoflurane neurotoxicity. Nevertheless, how mGluR7 activating ERK1/2 MAPK signaling to modulate sevoflurane exposure induced apoptosis remains unknown. In the preliminary experiments, we found that inhibition of β-arrestin-2 could reverse the neuronal protective effects of mGluR7 positive modulator AMN082 (N,N'-dibenzhydrylethane-1,2-diamine dihydrochloride). Therefore, we speculated that activation of mGluR7 may prevent sevoflurane induced neuronal apoptosis through β-arrestin-2 and ERK1/2 MAPK signaling pathway. The present study was designed to test this hypothesis using siRNA transfection, Laser scanning confocal microscope, flow cytometry, molecular biology and animal behavior techniques. This study is based on protein, cell and animal levels. These results may provide reliable experimental evidence and possible potential therapeutic approach for mitigating the risk of developmental anesthetic neurotoxicity.

中枢神经系统发育期七氟醚处理可引起神经细胞凋亡，进而导致持续到成年的学习记忆等认知功能损害，其机制尚不清楚。我们前期研究已证实，激活mGluR7受体可以缓解七氟醚处理引起的神经细胞凋亡，并且ERK1/2 MAPK信号发挥关键作用。但是mGluR7如何激活ERK1/2 MAPK信号调控神经细胞凋亡尚不明确。在预实验中，我们发现抑制β-arrestin-2的表达可以逆转mGluR7激动剂AMN082的神经保护作用。因此，我们推测mGluR7可能通过β-arrestin-2--ERK1/2 MAPK信号抑制七氟醚引起的神经细胞凋亡。本研究拟用转染siRNA、LCSM、FCM、分子生物学及动物行为学等技术，从蛋白-细胞-整体层面对该假设进行验证。该研究将为中枢神经系统发育期七氟醚神经毒性的产生机理提供可靠的实验室理论依据；同时可能为防治患儿七氟醚麻醉后可能出现的认知功能损害寻找干预靶点。

中枢神经系统发育期七氟醚处理可引起神经细胞凋亡，进而导致持续到成年的认知功能损害，其机制尚不清楚。本课题主要探讨了β-arrestins对mGluR7信号的调控作用及其对发育期七氟醚神经毒性的影响。我们的研究发现，七氟醚可使出生后7天的SD幼鼠和离体培养7天的原代海马神经细胞凋亡增加；应用III组代谢性谷氨酸受体激动剂LAP4和mGluR7受体激动剂AMN082可明显缓解七氟醚引起的神经细胞凋亡。分子机制实验发现，七氟醚可使mGluR7表达降低；应用beta-arrestin1 siRNA和beta-arrestin2 siRNA处理可使mGluR7表达则明显增加。beta-arrestin1 siRNA或beta-arrestin2 siRNA处理都可以降低LAP4的神经保护作用；然而，beta-arrestin2 siRNA处理可以降低AMN082的神经保护作用，beta-arrestin1 siRNA处理则对AMN082的神经保护作用没有明显影响。此外，七氟醚处理可降低磷酸化ERK1/2表达，应用LAP4或AMN082处理都可以增加P-ERK1/2表达。然而LAP4和AMN082对ERK1/2的作用可被beta-arrestin2 siRNA所逆转，对beta-arrestin1 siRNA则没有明显反应。该结果提示，beta-arrestin2在调控ERK1/2信号方面可能起关键的作用。另一方面，七氟醚处理明显降低了CBP和p300的蛋白表达水平，应用LAP4可明显增加CBP和p300表达，而应用AMN082则影响不明显。七氟醚处理还可以降低乙酰化H3和H4的表达水平，应用LAP4可以明显缓解对其的抑制。有趣的是beta-arrestin1 siRNA可以逆转LAP4的作用；然而beta-arrestin2 siRNA则无明显作用。综上结果提示，beta-arrestin1主要在细胞核内通过调控CBP/p300的相互作用；beta-arrestin2主要在细胞浆内通过调控ERK1/2来介导发育期七氟醚神经毒性过程。动物行为学结果发现LAP4或AMN082都可以明显缓解七氟醚处理引起的情绪和空间学习记忆功能异常。该研究将为CNS 发育期七氟醚神经毒性的产生机理提供可靠的实验室理论依据；同时可能为防治患儿七氟醚麻醉后可能出现的认知功能损害提供新的干预手段。