丙型肝炎病毒核心蛋白对天然淋巴细胞的调控机制研究

Innate lymphoid cells (ILCs) are defined as a new population of immune cells with important physiological function in recent years. However, the mechanism of innate lymphoid cells in HCV infection is not clear. Our primary data showed that Hepatitis C virus core protein triggered expansion and activation of CD4+CD25+ regulatory T cells mediated by TLR2. Moreover, HCVc inhibited CD4+ T cell proliferation and IFN-γ secretion in a Treg-dependent manner. This proposal will further clarify the mechanism how HCVc regulates the innate lymphoid cells. We hypothesized that HCVc may directly induce proliferation and inflammatory cytokines secretion of ILC2 and ILC3, thus leading to liver inflammation and injury during HCV infection; Furthermore, HCVc induced Treg activation which could inhibit the antiviral function of ILC1. We will develop in vitro ILC2 and ILC3 culture system, ILC1/Treg co-culture system, and use molecular biological and immunological techniques such as qRT-PCR、flow cytometry and Elisa to testify our hypothesis. This study will clarify the mechanism how HCVc regulates ILCs, and find the critical cytokines and molecules and finally lay the foundation for exploring the effect of ILCs in the morbidity of chronic hepatitis C patients and also provide a novel direction for targeted therapeutic interventions of ILCs needed for chronic hepatitis C treatment.

天然淋巴细胞(ILCs)是新定义的一类具有重要生理功能的免疫细胞，但ILCs在HCV病毒感染中的免疫机制尚不清楚。我们前期研究发现：HCV核心蛋白（HCVc）通过TLR2介导的途径诱导人外周血中Treg的增殖和激活，并以Treg依赖的方式抑制T细胞的增殖和IFNγ的产生。本项目拟进一步研究HCVc对ILCs的调控机制。我们提出：HCVc直接诱导ILC2和ILC3的增殖和炎性因子的产生，最终导致肝脏炎症和肝损伤；通过激活Treg抑制ILC1的增殖和抗病毒效应。我们将通过建立体外ILC2、ILC3细胞培养，ILC1/Treg共培养模型，利用qRT-PCR、流式、Elisa等分子生物学及免疫学技术验证我们的假说。本项目将揭示HCVc对ILCs的调控机制，发掘发挥关键作用的细胞因子和表达分子，为深入探讨ILCs在丙型肝炎发病中的作用机制奠定基础，并为临床提供一个靶向ILCs的丙型肝炎治疗的新思路。

HCV病毒core 蛋白具有重要的免疫调节功能。因此，我们猜测HCV core可能是导致HCV持续感染的原因之一。我们从健康供体分离外周血单个核细胞，加入HCVc或HCVcc刺激培养，对天然免疫细胞进行了检测。我们惊喜的发现，单核细胞受到HCVc或HCVcc刺激后，特征发生了明显改变，同时还能有效地抑制自体CD4+ T细胞的增殖和免疫学功能，这可能是促进和维持HCV病毒持续感染的一个重要原因。通过进一步文献查阅发现，丙型肝炎病毒（HCV）感染患者外周血单个核细胞（PBMC）中的骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)的比例相比正常人是升高的，我们推测MDSC的增多可能维持了HCV病毒的持续感染。然而，HCV病毒诱导MDSC细胞的机制尚不清楚。本项目中我们对HCV诱导MDSC，进而导致T细胞增殖抑制及促进调节性T细胞扩增这一机制进行了深入的研究。我们从健康供体外周血中纯化单核细胞，加入HCV core蛋白或细胞培养上清来源的HCV病毒颗粒（HCVcc）刺激培养，利用流式，实时定量PCR，ELISA和western blot等实验技术对这些单核细胞的表型和功能进行鉴定。另外，收集健康供体和慢性HCV感染患者的外周血，利用流式细胞仪检测外周血中MDSC细胞与CD4+CD25+CD127调节性T细胞的比例关系。我们的实验结果表明：HCV core蛋白和HCVcc均能上调人单核细胞IDO1，PD-L1和IL-10分子的表达，同时下调HLA-DR分子的表达。HCVc处理的单核细胞能够促进CD4+Foxp3+ 调节性T细胞的增殖，进而以IDO1依赖的方式抑制自体CD4+ T细胞的活化。我们发现HCVc或HCVcc是通过TLR2/PI3K/AKT/STAT3的信号通路诱导MDSC样的单核细胞产生。慢性HCV患者外周血中的单核细胞显示了MDSC细胞的特征，HCV病人的CD14+ MDSC的比例与CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的比例显著高于健康供体，同时其CD14+ MDSC的比例与CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的比例线性相关。本文揭示了导致HCV慢性感染的可能性机制之一，同时提出阻断MDSC的抑制功能可能有望提高慢性HCV感染患者的机体免疫反应。