基因信息与化学结构特性指导的膦酸类天然产物的发掘

Phosphonates (Phns) are a group of compounds containing carbon-phosphorus (C-P) bond in chemical structures. Naturally occurring Phns are widely spread and more than a dozen of naturally occurring small molecule Phns (NOSMPs) have been identified. These NOSMPs showed excellent bioactivity against a wide range of targets.For example,Fosfomycin is clinically used as an anti-infection agent and Phosphinothricin tripeptide is agriculturally used as a herbicide. It has been shown that the mechnism of naturally occurring C-P bond biosynthesis is highly conserved.All C-P bonds are generated from a phosphoenolpyruvate (PEP) intermolecular rearrangement reaction catalyzed by PEP mutase which is encoded by pepM gene.Moreover, the readout of Phns C-P bond from both mass spectrometer (MS) and nuclear magnetic resonance spectrometer (NMR) are specific. For instance, the NMR 31P chemical shift of Phns is more than 10 ppm, while the shift of phosphates is less than 5 ppm. When analyzed by MS, fragmentation of Phns generates more PO2- daughter ions, while phosphates produce more H2PO4- daughter ions. Therefore, we propose to develop a novel method of NOSMPs identification using both pepM gene screening and NMR/MS screening. The long term goal is to characterize chemical structures as well as biosynthesis pathways of these newly identified Phns.

膦酸类化合物是指分子结构中含有碳磷键的化合物，膦酸类天然产物在自然界中广泛存在，但是已经鉴定结构的膦酸小分子天然产物并不多。膦酸小分子天然产物大多具有良好的生物学活性，已知的十数个化合物中就有两个被开发成药：磷霉素（抗感染药物）和草胺膦（除草剂）。膦酸类天然产物碳磷键的生物合成非常有规律，至今所知它们都是由磷酸烯醇式丙酮酸变位酶（PEP Mutase）催化的PEP分子内重排反应生成的。膦酸类化合物的碳磷键具有非常强的仪器检测特异性，核磁共振仪检测时膦酸类化合物的31P化学位移大于10 ppm，而磷酸酯类化合物的31P化学位移小于5 ppm；质谱仪检测时膦酸类化合物断裂产生的PO2-子离子比H2PO4-子离子多，而磷酸酯类化合物断裂产生的PO2-子离子比H2PO4-子离子少。据此，本项目将先进行基因筛选然后通过仪器筛选，发掘新的膦酸小分子天然产物，并鉴定其化学结构、解析其生物合成途径。

为了从微生物中发现新的膦酸天然产物，本研究组从西藏、祁连山、青海湖等高海拔地区采集土样78份，分离了超过2000株菌株。设计pepM基因简并引物，通过PCR筛选菌种库，得到234个pepM+的菌株。含有pepM基因的菌株发酵液，制样以后分别通过质谱和核磁共振仪检测，我们找到了WDP096，WDP299，WDP301，WDP311，WDP1699共计五个菌株。此类菌株发酵液中的目标化合物31P NMR化学位移大于10 ppm，断裂能够产生荷质比为63（PO2¬-）和79（PO3-）的子离子，母离子的分子量不与任何已知的化合物分子量相同。这表明这五个菌株能够产生新的膦酸天然产物。对WDP096的发酵液进行膦酸化合物分离、纯化和结构鉴定，我们找到了对细菌和真菌具有广泛抑杀活性的新型膦酸天然产物Phosacetamycin，将其命名为磷酰霉素。对于31P NMR检测有大于10 ppm的共振信号，但是不含有pepM基因的菌株，我们也进行了挖掘，并且发现了新的含磷天然产物硫磷酰化鸟氨酸（Nδ(N-sulfo-diaminophosphinyl)-ornithine, PSOrn）。硫磷酰化鸟氨酸能够抑制鸟氨酸氨甲酰基转移酶（Ornithine transcarbamylase）的活性，从而阻断精氨酸的合成，表现出广谱的抗菌能力。本项目阐明了硫磷酰化鸟氨酸产生菌株的自我保护机制，揭示了一个新的精氨酸补偿合成途径。对于含有pepM基因，但是NMR检测没有发现31P共振信号的菌株，我们选取了部分菌株进行高通量测序。通过对基因组草图的分析，我们发现了一系列潜在的含磷天然产物的生物合成基因簇，并对其中的一个基因簇进行了激活表达。结果表明该基因簇负责合成一个31P化学位移在10.9 ppm的含磷天然产物，分子量不与任何已知的天然产物分子量相同。我们还对母离子扫描发现新化合物的质谱方法进行了拓展应用，找到了一个新的吡咯酰胺类化合物。该新化合物是远端霉素和纺锤菌素的杂合体，但是比他们表现出更强的DNA结合活性，具有良好的肿瘤抑制潜力。