新型抗肿瘤抗生素力达霉素辅基蛋白表达和发色团产生的协调机制研究

力达霉素（又名C-1027）由一个烯二炔发色团和一个辅基蛋白组成，是一种具有极强抗肿瘤活性的烯二炔类抗生素，已在我国进入临床II期研究，有望发展为具有自主知识产权的新药。力达霉素生物合成基因簇已被克隆，对其生物合成途径和调控机制的研究已取得进展，而对辅基蛋白表达调控及其与发色团合成的协调机制的研究仍属空白。本课题拟对辅基蛋白表达及发色团合成的时间曲线进行比较分析；采用实时定量RT-PCR、Western blot、报告基因法和凝胶阻滞实验等确定调控辅基蛋白表达的调节基因和调控方式；构建辅基蛋白基因阻断、互补和过表达菌株，分析野生菌株和重组菌株中发色团产量变化、结构基因表达的差异等，探讨辅基蛋白基因表达与发色团合成的协调机制。本项目的研究结果将丰富对力达霉素生物合成机制的认识，为应用代谢工程手段获得力达霉素的高产菌株和用组合生物学方法研制新型抗肿瘤药物奠定理论基础。

力达霉素（又名C-1027）由一个烯二炔发色团和一个辅基蛋白组成，是一种具有极强抗肿瘤活性的烯二炔类抗生素，已在我国进入临床II期研究，有望发展为具有自主知识产权的新药。力达霉素生物合成基因簇已被克隆，对其生物合成途径和调控机制的研究已取得进展，而对辅基蛋白表达调控及其与发色团合成的协调机制的研究仍属空白。本课题首先对辅基蛋白表达及发色团合成的时间曲线进行比较分析，发现辅基蛋白的表达略早于发色团产生。通过构建辅基蛋白基因阻断、互补和过表达菌株，并对菌株中发色团产量和活性分析显示阻断辅基蛋白基因后发色团仍然产生，但由于缺少辅基蛋白的保护，发色团失去抗菌活性。结构基因表达的差异分析也显示辅基蛋白基因的阻断并不影响合成发色团基因的表达,例如sgcA1, sgcC4, sgcD6 和sgcE。采用实时定量RT-PCR、Western blot和凝胶阻滞等实验确定了四个力达霉素生物合成调节基因sgcR, sgcR3, sgcR1 和sgcR2之间的关系，构建了力达霉素生物合成调控网络；确定了调控网络中调节辅基蛋白表达的基因是sgcR2，sgcR2同时还控制多数发色团生物合成基因的表达，以协调辅基蛋白和发色团的产生；而另一调节基因sgcR1调控发色团烯二炔核心合成基因的表达，sgcR1和sgcR2的共转录，可使发色团烯二炔核心结构、辅基蛋白以及发色团的其他部分的合成协调产生，由此精确调控力达霉素的生物合成。本项目的研究结果丰富了力达霉素生物合成机制的认识，为应用代谢工程手段获得力达霉素的高产菌株和用组合生物学方法研制新型抗肿瘤药物奠定了理论基础。