基于TLR2－NF-κB信号转导研究黄芩苷抗类风湿关节炎的分子机制

The main pathological characteristics of Rheumatoid arthritis (RA) is the excessive proliferation and secretion of inflammatory cytokines . Due to the current medicine for RA is not conducive to the RA control, so it is imperative to develop the effective, lowly toxic medicine for RA. Many of the traditional Chinese medicine in the clinical treatment for RA contains radix scutellariae, and its main effective components is baicalin. Our initial experiments found that baicalin has very low toxicity and can significantly increase the expression of H3K4 methylation transferase ASH1L and inhibit the secretion of IL-6 . According to RA synovial fibroblasts (RASFs) reports, ASH1L can prevent the occurrence of inflammatory autoimmune disease development.We infer that baicalin may incease the ASH1L expression in RA synovial membrane by negative regulatig of TLR2 -Myd88 mediated the NF-kB signaling, thus reducing the secretion of inflammatory cytokines; To prepair animal models of RA, and after the baicalin intervention, evaluate effect of medicine by analysing the pathological degree of improvement of joint ; Molecular biology methods were used on animals (RA) in vivo and in vitro (RASFs) to verify the effects of baicalin on key molecules of ASH1L, H3K4 methylation and TLR2 -Myd88 mediated the NF-kB pathway .This subjects was done to test the therapeutic effect of baicalin on RA and its anti-inflammatory molecular mechanisms.

RA的主要病理特点是病变关节滑膜过度增生和分泌促炎细胞因子。目前的抗RA药不利于RA的控制，故研制有效、低毒的抗RA药势在必行。临床治疗RA的许多复方药中含有黄芩,而黄芩的主要有效成分是黄芩苷。我们前期研究发现黄芩苷毒性很低，可显著增强RA患者滑膜成纤维细胞（RASFs）表达H3K4甲基化转移酶－ASH1L且抑制IL-6的分泌。有报道ASH1L可阻止炎症性自身免疫病的发生发展，由此推断黄芩苷可能通过上调RA滑膜ASH1L的基因表达、负调控TLR2－Myd88介导的NF-κB信号转导，进而抑制炎性细胞因子的分泌；建立RA动物模型，经黄芩苷干预治疗后，通过分析病变关节的病理改善程度评价药效；采用分子生物学方法从体内(RA动物)及体外(RASFs)两方面验证黄芩苷对ASH1L、H3K4甲基化及TLR2－Myd88介导的NF-κB转导途径关键分子的影响，探寻黄芩苷对RA的作用及其抗炎分子机制。

类风湿关节炎(RA)是一种以关节病变为主的全身性自身免疫性疾病，其主要病理特征为关节滑膜成纤维细胞的增生及持续慢性炎症等。未及时诊治的患者两年致残率达50%，三年致残率达70%，近年该病呈上升趋势，因此，研发有效治疗RA的药物意义重大。黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，是我国传统中药材。黄芩主要有效成分是黄芩苷，临床上许多清热解毒、抗菌消炎的中成药都含有黄芩苷。本课题组前期研究表明黄芩苷具有良好的抗流感病毒性肺炎、肺纤维化作用及毒性小的优点。至今，有关黄芩苷干预治疗类风湿关节炎的药效及机制研究少有报道。 .II型胶原诱导性关节炎(CIA) 是目前最为常用的关节炎模型，该模型具有与人类RA相似的免疫学与病理学特征。本课题研究首先在确保RA模型制备成功的基础上，进行后续实验。 在X-ray和HE染色切片光镜下观察发现，模型组滑膜层明显增厚，滑膜下层有大量滑膜成纤维细胞增生，间质内可见大量炎性细胞浸润; 与模型组相比，虽然黄芩苷60、30mg/kg治疗组的滑膜层变化不明显，但滑膜成纤维细胞的增生及炎性细胞浸润水肿明显减轻，可见黄芩苷的确具有良好的消除炎症作用。在滑膜组织机制研究方面，实时荧光定量PCR实验结果及Western-blot 实验结果显示，黄芩苷60、30mg/kg治疗组TLR2、MyD88及NF-kB的mRNA及蛋白表达量明显降低； 同理，在HFLS-RA细胞中黄芩苷100 50及25 μg /ml干预组TLR2、MyD88及NF-kB的mRNA及蛋白表达量明显降低。表明黄芩苷良好的消除炎症作用很可能是通过抑制TLR2-NF-kB通路的活化来实现的。另外，本研究表明黄芩苷100、 50及25μg /ml 浓度可有效抑制HFLS-RA细胞中miR－21及TGF-β1的mRNA表达，显著抑制TGF-β1及FN蛋白表达，进而促进Smad7蛋白表达。说明黄芩苷作用机制可能是通过抑制滑膜成纤维细胞的miR-21表达进而促进Smad7蛋白表达发挥其负调节功能相关。黄芩苷抗炎的免疫分子机制可能还与其抑制病原体刺激未成熟树突状细胞的成熟及其抗原呈递分子MHCII 的过度表达相关。项目从实施到结题培养了2名硕士研究生，1名本科生，发表中文核心期刊论文3篇，为后续的研究奠定了良好的基础。