microRNAs调控uPA基因表达在骨关节炎中的作用研究

尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶，近年来发现其在骨关节炎软骨降解过程中发挥着极其重要的病理作用。它不但可以直接对软骨进行降解，更为重要的是激活基质金属蛋白酶系统来发挥更为强大的软骨降解作用，但是目前对其表达调控方面的研究较少，而微小RNA对其调控的研究更少。本研究以SD大鼠为研究对象，应用生物信息学、基因转染方法和RT-PCR、western-blot等分子生物技术相结合，通过体内、体外两部分实验，从uPA基因的一种重要的内源性调控模式即microRNA对靶基因uPA的调控方面着手，通过上调和抑制miR-27a和miR-146a来分析验证其对uPA基因表达的调控作用，旨在明确uPA在体内表达调控的重要途径，为进一步研究uPA调控应用于人骨性关节炎治疗、预防提供有效依据，探索新的思路。

本项目通过miR-27a调控uPA基因和蛋白表达水平为研究，探讨uPA基因的内源性调控手段——即通过上调或者抑制miR-27a下调uPA基因表达，从而达到治疗OA的目的。课题首先构建了SD大鼠OA模型，并对OA 4/8/12周软骨组织中的miR-27a、miR-146a、uPA和MMP-3 基因表达进行了检测及分析，结果显示随着病程的延长，软骨组织表达miR-27a、miR-146a水平明显降低，而uPA和MMP-3表达逐渐升高，二者之间呈现负相关关系。应用生物信息学软件分析显示rno-miR-27a同uPA有较强的结合位点，符合本研究进一步实验。.随后构建软骨细胞OA模型，并应用pre-miR-27a、anti-miR-27a寡核苷酸、空质粒及生理盐水对软骨细胞进行干预，检测培养液中uPA和MMP-3的基因和蛋白表达见：应用pre-miR-27a干预后软骨细胞表达uPA和MMP-3水平均较其他对照组显著降低，而anti-miR-27a干预后uPA和MMP-3的基因和蛋白表达均较其他组显著升高。pre-miR-27a可促进软骨细胞的增殖及生长，减弱其凋亡。同期构建了基于FRET原理的双荧光uPA生物传感器，应用pre-miR-27a和anti-miR-27a干预软骨细胞，在活细胞下观察到pre-miR-27a可显著抑制软骨细胞表达uPA的水平，而anti-miR-27a可增加uPA的表达水平。.通过构建SD大鼠OA模型，并应用pre-miR-27、anti-miR-27a 真核表达载体、空载体及生理盐水关节腔内注射，观察软骨组织的退变及软骨组织中uPA和MMP-3的基因和蛋白表达水平。结果显示，pre-miR-27a干预后软骨组织退变减弱，软骨组织表达uPA和MMP-3的基因和蛋白水平均较其他对照组显著降低，而应用anti-miR-27a后软骨组织退变加速，uPA和MMP-3表达水平显著升高。.研究表明miR-27a可负向调控软骨组织表达uPA的水平，通过过表达miR-27a可使uPA和MMP-3在软骨组织中的表达显著降低，从而缓解软骨降解病变，达到延缓OA的病变进程。本课题明确了uPA的microRNA调控途径，为今后开发出调控uPA基因表达的药物提供理论依据，为OA的靶向基因治疗提供新的理论和实验依据，为临床OA的治疗探索新方法和新思路。