光敏感蛋白ChR2调节实验性自身免疫性葡萄膜炎的视觉损伤作用研究

Uveitis is a group of common vision loss eye disease that most happens in young adults. Looking for reasonable and effective treatment has been a problem to be solved in the ophthalmology. Early research has shown that the excessive proliferation and polarization of Th1、Th17, the imbalance of regulatory T cells play important roles in the intraocular inflammation of EAU, but targeting these factors is still not fully recovered the visual function damage in the late stage of uveitis. Photoreceptor apoptosis is a key in the irreversible visual damage of EAU. Light-sensitive opsin ChR2 is an ion channel, when transferred cell illuminated with light, the photocurrent makes the cell depolarization. Recent studies have shown that after light-sensitive gene ChR2 expressed in the specific organization, makes the recovery of nerve cell function or alternative treatment possible. We proposed in this study that by retinal injection of ChR2, in visual function damage EAU that caused by photoreceptor cells apoptosis, application of light with correct frequency activates ChR2 to establish retinal circuit. The present study will provide the new idea for the treatment of uveitis.

葡萄膜炎是一类多发于青壮年的常见治盲眼病，寻找合理且有效的治疗方法，一直是眼科领域中一个亟待解决的问题。前期研究表明Th1、Th17的过度极化和增殖以及调节性T细胞的失衡在EAU眼内炎症的发生发展起重要作用，但以此为靶点仍不能完全恢复葡萄膜炎后期的视功能损伤，光感受器细胞凋亡是EAU不可逆视觉损伤的关键环节。光敏感蛋白ChR2是一种阳离子通道蛋白，受光脉冲刺激可形成光电流，从而使细胞发生去极化反应。最近研究表明光敏感基因ChR2在特定组织中表达后，使神经细胞功能的恢复即替代性治疗的方法成为可能。本研究假设通过小鼠视网膜下导入ChR2，在光感受器细胞功能损伤导致视觉丧失后的EAU小鼠中，应用光源激活光敏蛋白ChR2而重新建立视网膜光感受器细胞下游ON-双极细胞和神经节细胞的视觉通路，为致盲性眼病葡萄膜炎的治疗提供新的思路。

背景研究发现糖尿病性视网膜神经病变的发生早于糖尿病视网膜病变（DR），视网膜神经节细胞（RGCs）的损伤是DR的早期特征性改变。研究表明，Toll样受体4（TLR4）在糖尿病大鼠视网膜中呈高表达，但TLR4与糖尿病性RGCs损伤的关系尚不明确。目的研究高糖对原代培养的大鼠RGCs中TLR4表达的影响，为糖尿病性视网膜神经病变的预防和治疗以及靶向药物研究提供依据。方法采用木瓜蛋白酶消化法从出生后1～3 d的SPF级大鼠视网膜中分离RGCs并进行纯化培养，采用免疫荧光技术检测RGCs特异性标志物Brn3a的表达以鉴定培养的细胞。将培养的细胞分为正常对照组及10、20、30 mmol/L葡萄糖组，分别于不同浓度葡萄糖培养后24 h及48 h收集细胞，分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定RGCs中TLR4 mRNA及其蛋白的相对表达量。结果细胞接种后贴壁生长并呈近圆形，纯化培养后24 h细胞体积逐渐增大且呈聚集样岛状生长，可见突触和轴突。培养的细胞中Brn3a为阳性表达。葡萄糖培养后24 h岛样细胞群周边细胞轮廓不清，反光弱，葡萄糖培养后48 h部分细胞内结构消失，仅残留细胞轮廓，可见大量细胞碎片。细胞培养后24 h，10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4 mRNA相对表达量分别为0.945±0.237、1.180±0.193和0.827±0.213，培养后48 h分别为1.509±0.422、2.433±0.617和1.435±0.410，均明显高于正常对照组的0.600±0.099和0.724±0.302，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。细胞培养后24 h，10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4蛋白相对表达量分别为0.442±0.147、0.626±0.128和0.330±0.153，培养后48 h分别为0.464±0.121、0.930±0.441和0.394±0.158，均明显高于正常对照组的0.090±0.050和0.094±0.070，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。结论高糖环境下大量体外培养的RGCs细胞内结构消失，同时细胞中TLR4表达量上调，提示RGCs中TLR4的过量表达可能与高糖诱导的GCs损伤有关。