益气提升法对脱垂性内痔组织抗衰老蛋白Fibulin家族表达的影响研究

On the basis of Tonifying Qi method in treatment of prolapsed hemorrhoids with good clinical curative effect, with molecular biology research methods, this study is to determine mRNA and protein expression of Fibulin 3, Fibulin 5 in the different levels of prolapsed hemorrhoids and by studying the different expression of mRNA and protein of Fibulin 3, Fibulin 5 in the different levels of prolapsed hemorrhoids, to reveal the intrinsic relevance of Fibulin proteins family with the occurrence and development of prolapsed hemorrhoids. At the same time, this study with apply of clinical analysis and molecular biology methods, after the intervention of YiQi granules, is to dynamically analyze the expression of Fibulin family in the different levels of prolapsed hemorrhoids, is to study the mechanism of Tonifying Qi method in treatment of prolapsed hemorrhoids, and to reveal the pathways of the Tonifying Qi method through anti-aging effect of Fibulin proteins family. The study is to seek the molecular biological evidence for anal cushion down theory and to provide modern scientific basis for the traditional Chinese medicine diagnosis and treatment of prolapsed hemorrhoids.

在益气提升法治疗脱垂性内痔取得良好临床疗效的基础上，本研究应用分子生物学研究的手段，测定不同脱垂程度的内痔标本中的Fibulin-3 、Fibulin-5 mRNA及蛋白的表达量，通过研究不同程度脱垂性内痔组织中Fibulin家族mRNA及蛋白的表达水平的差异，探讨Fibulin蛋白家族与脱垂性内痔发生、发展的内在关联性。同时，本研究应用临床分析研究和分子生物学研究的手段，在补中益气颗粒干预后，分析研究对象内痔组织中Fibulin蛋白家族表达的动态表化，深入研究益气提升法治疗脱垂性内痔的作用机理，揭示益气提升法通过延缓Fibulin蛋白家族衰老、治疗脱垂性痔病的作用通路。本课题的设计出发点在于为肛垫下移学说寻求分子生物学的证据；为中医药理论诊断、治疗脱垂性内痔提供现代科学依据。

目的：通过比较分析三种不同中医证型的脱垂性内痔肛垫组织中Fibulin家族蛋白和金属基质蛋白酶MMP9的表达，研究脱垂性内痔肛垫组织中Fibulin家族蛋白、MMP9的表达与脱垂性内痔发生的关系，阐释不同中医证型脱垂性内痔的发病特点，为指导中医临床辨证治疗提供依据。方法：收集脱垂性内痔的肛垫组织标本54例（湿热下注型21例，气滞血瘀型18例，气血两虚型15例），以及不伴内痔的结直肠息肉患者的正常肛垫组织标本10例，采用HE染色、 PCR、Western-blot、 明胶酶谱技术从组织-基因-蛋白层次系统研究Fibulin-3、 Fibulin-5、 MMP9的表达分布，并对不同证型的脱垂性内痔组织的表达进行比较分析。结果：1.研究发现在湿热下注证、气滞血瘀证及气血两虚证三个中医证型中Fibulin-3的mRNA表达呈递减趋势（湿热下注证＞气滞血瘀证＞气血两虚证），Fibulin-3蛋白的表达量在气血两虚证中表达最高。2 .MMP9的mRNA表达量在三种证型中水平统计学无显著性差异，但在气滞血瘀证中表达量相对较高；MMP9蛋白的表达量在气滞血瘀证中水平相对较低。3. Fibulin-5的mRNA表达量在湿热下注证、气滞血瘀证及气血两虚证三个中医证型中呈依次递减的趋势（湿热下注证＞气滞血瘀证＞气血两虚证），其蛋白的表达量亦是气血两虚证中表达最强，与Fibulin-3趋势一致。4.在气滞血瘀证组中，Fibulin-3蛋白表达与MMP9蛋白表达具有一致性。5.在气血两虚证组中，Fibulin-3和MMP9的蛋白表达呈一致性，蛋白表达水平在三组中最高，且蛋白活性趋势与蛋白表达一致。结论：1.从行肠镜切除息肉（不伴内痔）过程中获取正常肛垫组织作为对照组，从PPH术后标本获得肛垫组织作为实验组，两者具有可比性。2. Fibulin-3、-5及MMP9在湿热下注证、气滞血瘀证及气血两虚证的脱垂性内痔肛垫组织中的蛋白表达均高于正常肛垫组织。在气滞血瘀证组中三种蛋白表达水平相对较低。3.在脱垂性内痔疾病中，Fibulin-3的表达增加可能导致MMP9的活性增高，加快肛垫中弹性纤维崩解，从而导致肛垫病理性移位。4. Fibulin-5表达水平的增高可能使肛垫支持结构弹性能力下降，从而促进脱垂性内痔的发生。5. Fibulin-3、-5对气滞血瘀证内痔影响可能与湿热下注证、气血两虚证不同。