基于分子设计的新型蛋白A免疫吸附材料制备及性能研究

Protein A immunoadsorption therapy is a novel and effective method for treating autoimmune disease and organ transplantation immunological rejection. The immunoglobulins and immune complexes in the patient's blood are adsorbed selectively so as to purify the blood to alleviate or cure the disease. Based on the fact that the natural protein A immunoadsorption material has the low adsorption performance and cannot resist high temperature for sterilization and strong alkali for removing the endotoxin, the wide clinical application of protein A immunoadsorption therapy is restricted because of the clinical risk. In this project, A novel protein A immunoadsorption material with the high adsorption performance will be prepared through orderly coupling the C or N terminal of protein A to the Sepharose 6FF carrier based on the genetic engineering techniques and molecular design.Generally, the protein resin is prepared by disorderly coupling the protein on the carrier resulting in the low adsorption capacity. The instable amino acid residues are mutated on the premise of maintaining the conformation of protein A and A protein A immunoadsorption material with high stability will be prepared. Finally, the adsorption performance and clinical safety are evaluated in vivo. This project will explore the relationship between the space structure of protein A coupled on the carrier and the adsorption performance, and provide a meaning study direction for increasing the stability and adsorption performance of the separation media coupled with proteins.

蛋白A免疫吸附疗法是治疗自身免疫性疾病和器官移植排斥反应的一种新疗法。它通过选择性清除患者血液中的免疫球蛋白及其免疫复合物，从而达到净化血液、缓解或治愈病情的目的。基于天然蛋白A偶联到凝胶载体上后吸附性能较低，而且不耐受高温灭菌和强碱去除内毒素，限制了其广泛的临床应用。为解决这些问题，本项目拟通过分子设计的原理，利用基因工程技术在蛋白A的N端或C端引入活性基团，实现蛋白A有序链接在琼脂糖凝胶6FF载体上，解决目前蛋白质类介质无序偶联在载体上的问题，制备得到高吸附性能的新型蛋白A免疫吸附材料。在保留蛋白A空间构象的前提下，通过基因突变不稳定的氨基酸残基，使蛋白A免疫吸附材料能耐高温灭菌和强碱去除内毒素。最后通过生物相容性研究和动物试验综合评价吸附材料的吸附能力和临床安全性。本项目将揭示蛋白A在载体上的空间结构与其吸附性能的关系，为合成高吸附性能的蛋白质类吸附介质提供新的研究思路和理论依据。

由于与免疫球蛋白G（IgG）Fc区域的特异性亲合作用，基于蛋白A配基的吸附材料被广泛应用于抗体的纯化和清除，蛋白A免疫吸附疗法成为治疗自身免疫性疾病和器官移植排斥反应的一种新疗法。德国费森尤斯医疗器械公司将天然蛋白A共价固定在溴化氰活化的琼脂糖凝胶微球上，用于清除致病抗体治疗血友病等各类自身免疫性疾病。但由于天然蛋白A由5个Fc结合区域（EDABC区域）和非结合区组成，非结合区的存在降低了蛋白A对IgG的吸附能力。另外，蛋白A表面的伯氨基与氰基的共价反应，其反应位点很可能涉及到蛋白A的生物活性中心，这些因素都导致蛋白A免疫吸附材料吸附性能较低（费森尤斯Immunosorb产品IgG吸附量约为20 mg/mL），从而提高了其临床应用成本，限制了该技术广泛受益于众多的自身免疫性疾病患者。. 基因工程技术和蛋白质定向固定方法为解决以上问题提供了可能。通过基因工程技术，可以剔除天然蛋白A中的Fc非结合区，制备结合区（例如B结合区）的串联体，合成生物活性更高的重组蛋白A。另外，蛋白质定向固定方法常用于酶的固定，通过各种技术控制蛋白质的反应位点，实现蛋白质的有序固定，使活性中心充分暴露。近几年，酶的定向固定技术非常活跃，其应用主要集中在提高酶的稳定性和催化效率上。将这些技术应用于亲合材料方面，有望制备出吸附性能提高的蛋白A免疫吸附材料。. 本项目的主要工作是合成不同长度B结合区串联体的重组蛋白A（B1~B4），结合产率和吸附性能选取合适的重组蛋白A。通过分析其生物活性区域，我们采取各种定向固定方法化学交联到琼脂糖凝胶微球上。我们设计了不同方法，制备了各种定向固定的蛋白A免疫吸附材料，考察它们的吸附性能，成功制备了吸附性能提高2倍左右的产品（50~60 mg/ml），并和系统性红斑狼疮患者血浆进行了体外试验。此外，该项目引起企业关注，和企业签订了长期合作协议，目前产品在企业进行了中试，预计年中进入动物试验阶段，明年进入临床试验。