土壤熏蒸剂氯化苦对尖孢镰刀菌的作用靶基因及分子作用机制研究

随着全球甲基溴淘汰计划的深入开展,氯化苦已成为最有应用前景的替代品。氯化苦土壤熏蒸能有效防治多种土传病害，但其作用机理至今尚未清晰揭示。为明确氯化苦对病原真菌的分子作用机制，项目组前期以氯化苦熏蒸处理土传病原真菌- - 尖孢镰刀菌为研究模型，采用超高通量转录组分析技术构建了26万余条尖孢镰刀菌转录组测序文库，生物信息学分析结果显示尖孢镰刀菌丙酮酸脱氢酶α亚基基因（PDHE1α）为氯化苦的潜在作用靶标。本项目将首先采用qRT-PCR技术证实尖孢镰刀菌PDHE1α基因是氯化苦的作用靶基因；然后采用体外酶动力学研究方法明确氯化苦对丙酮酸脱氢酶分子靶标的作用活性位点及分子作用模式；最后清晰揭示氯化苦对尖孢镰刀菌的作用靶基因及分子作用机制。本研究将为土壤熏蒸剂氯化苦的推广应用提供新的理论依据和科学指导，也为研究其他农药的作用靶基因及作用机制提供新的思路和方法。

为明确氯化苦对病原真菌的分子作用机制，项目组前期以氯化苦熏蒸处理土传病原真菌--尖孢镰刀菌为研究模型，采用超高通量转录组分析技术构建了26万余条尖孢镰刀菌转录组测序文库，qRT-PCR技术证实尖孢镰刀菌丙酮酸脱氢酶α亚基基因（PDHE1α）受氯化苦诱导高度表达且较对照升高了17.5倍，同时研究发现氯化苦熏蒸导致尖孢镰刀菌胞内丙酮酸含量升高了2.7倍，首次发现了PDHE1α为氯化苦对尖孢镰刀菌的潜在靶基因。首次建立了尖孢镰刀菌PDH酶分离纯化方法并成功分离到PDHE1α，E3，E2和E1β四个蛋白质亚基。尖孢镰刀菌PDH酶抑制剂体氯化苦外筛选模型结果显示PDH酶的Km值为3.794 μmol/L，Vmax为0.271 μmol/(L•min)；乙酰基膦酸甲酯单钠盐的酶抑制常数(Ki)为50.2 nmol/L，半数抑制浓度(IC50)为11.3 nmol/L，曲线图分析为反竞争性抑制剂；氯化苦的Ki为15.48 nmol/L，IC50为6.3 nmol/L，曲线图分析为竞争性抑制剂。尖孢镰刀菌丙酮酸脱氢酶化学修饰和紫外吸收光谱变化结果显示随着两种巯基修饰剂浓度增大，酶活力迅速下降，直至完全丧失，初步证实了在尖孢镰刀菌丙酮酸脱氢酶α亚基（PDHE1α）分子中，巯基是构成酶活性中心的必需基团之一。本项目首次揭示了氯化苦对尖孢镰刀菌的作用靶基因及分子作用机制。这将为土壤熏蒸剂氯化苦的推广应用提供新的理论依据和科学指导，也为研究其他农药的作用靶基因及作用机制提供新的思路和方法。