兼具nNOS-Capon解偶联和抗氧化活性的双重神经保护剂的设计、合成及生物活性评价

Ischemic stroke is one of the most leading disabling and lethal diseases in the world. The NMDAR-PSD95-nNOS-Capon signaling pathway plays an important role in the transmission of nerve excitotoxicity, and the uncoupling of nNOS-Capon has a neuroprotective effect. In addition, the body generates a large number of free radicals to accelerate the death of nerve cells in the process of ischemia and reperfusion. SS-31 (D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2), with similar function of Tat, is a stable tetrapeptide, which can go through the blood-brain barrier. SS-31 has a significant antioxidant activity, which is also used as drug carrier. In this study, some SS-31-Capon conjugates are designed and synthesized to get potential neuroprotective drugs which display the nNOS-Capon uncoupling effect and antioxidant activity. The lead compounds will be assayed to get some potent neuroprotective agents, which will lay a good foundation for obtaining some new neuroprotective drugs with independent intellectual property rights.

缺血性脑卒中是世界上最主要的致残和致死疾病之一。NMDAR-PSD95-nNOS-Capon信号通路在神经兴奋性毒性的传递中起重要作用，解开nNOS-Capon的偶联具有神经保护作用。另外，缺血及再灌注过程中产生的大量自由基加速神经细胞的死亡。SS-31（D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2）是稳定的、能通过血脑屏障的、具有Tat样功能的四肽分子，该肽具有显著的抗氧化活性和药物载体功能。在本研究中，我们计划设计并合成SS-31缀合的Capon羧基末端分子，这样的分子具有nNOS-Capon解偶联的神经保护作用，且具有抗氧化的神经保护活性。对合成的化合物进行生物活性研究，得到具有优良神经保护作用的先导化合物，为获得具有自主知识产权的全新神经保护剂打下基础。

缺血性脑卒中是世界上最主要的致残和致死疾病之一。缺血性脑卒中发生时，兴奋性氨基酸（EAA）的毒性作用在缺血脑卒中的发病机制中起重要作用。研究表明NMDAR-PSD95-nNOS信号通路介导脑卒中兴奋性谷氨酸的毒性作用。但由于NMDAR和nNOS介导很多重要的生理功能，抑制其活性会产生较多的毒副作用。例如临床研究表明，NMDAR拮抗剂因其副作用不能开发成治疗药物。兴奋毒性刺激时，刺激信号通过NMDAR-PSD95-nNOS传给nNOS，nNOS和Capon偶联，Capon还可以和MKK3偶联，形成nNOS-Capon-MKK3三元复合物。nNOS可以激活MKK3，从而激活p38MAPK信号通路，导致神经细胞死亡。研究表明，抑制nNOS-Capon的偶联具有神经保护作用。本研究以nNOS-Capon蛋白蛋白相互作用为靶点，以capon羧基末端四肽为先导化合物，设计合成了一系列的N-cyclohexylethyl-[A/G]-[D/E]-X-V多肽通过竞争性与nNOS PDZ结构域结合，从而抑制nNOS-Capon的偶联。通过表达GST-nNOS1-133蛋白，设计合成5-FAM-KV-5-Capon(496−506)肽(5-FAM-KSGLGDGLDDEIAV)荧光探针，探索蛋白与探针作用的最适浓度，作用时间，DMSO百分浓度等影响因素，构建荧光偏振高通量筛选nNOS-Capon偶联剂平台。FP和等温滴定量热（ITC）测试(ΔH=−1670±151.0 cal/mol)显示化合物N-Cyclohexylethyl-ADAV对nNOS PDZ结构域的亲和力最强。为了提高生物利用度、亲脂性和膜透性，采用Asp甲基化优化得到N-cyclohexylethyl-AD(OMe)AV，该化合物显示在体外平行人工膜透性试验(PAMPA)-BBB (Pe=6.07 cm/s)和体内试验中均具有良好的血脑屏障(BBB)透性。在120 min大脑中动脉闭塞(MCAO)实验中，N-cyclohexylethyl-AD(OMe)AV (10 mg/kg体重，再灌注后立即尾静脉给药)显著减少大鼠脑部梗死面积。本课题中筛选到能够通透血脑屏障、生物利用度高的、具有nNOS-Capon 解偶联作用神经保护候选药物，为神经保护药物的发展提供新思路