SOD1作为氧化应激转录因子在肝癌发病中的作用和临床意义

Superoxide dismutase 1 (SOD1) has been known for catalysis of superoxide to hydrogen peroxide in cytoplasm. An early study in mice showed that SOD1 deficiency leads to increased incidence of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the mechanism of SOD1 deficiency promoting the HCC is unclear. Our recent studies found that SOD1 has a new function that SOD1 is re-localized from cytoplasm to nucleus inducing by oxidative stress and regulates the transcription of many oxidative stress-related genes in yeast. To this end, we found that ROS can rapidly cause the re-localization of SOD1 into the nucleus, inducing SOD1 binding to the promoters of CCND1 and CHAC1 genes. The GAL4-DBD-SOD1 fusion protein assay demonstrated that SOD1 can indeed activate transcription. We therefore hypothesized that SOD1 represses the development and progression of HCC via regulating oxidative stress-related genes transcription. On this basis, we will explore: 1) the DNA binding domain, transcription activating domain and targeting genes of SOD1; 2) to observe the influence of SOD1 acting as a transcription factor on HCC cell biological behaviors and tumor formation and metastasis in vitro and in vivo and analyze SOD1 expression in nucleus and targeting genes expression of HCC by immunohistochemistry in order to elucidate its clinical significance; 3) we will further investigate the mechanism of how SOD1 regulates the targeting gene expression. If successful, this study will gain an insight into the molecular mechanism of SOD1 acting as a transcription factor and its role in the pathobiology and clinical significance of HCC, which should help prevent pathogenesis and lead to a potential new drug target for HCC.

超氧化物歧化酶1（SOD1）一般在细胞浆内发挥清除超氧阴离子自由基。研究表明，SOD1敲除鼠的肝癌发生率明显增加，但机制尚不清楚。我们在ROS刺激酵母的研究中首次发现SOD1从胞浆进入胞核并调控氧化应激相关基因的转录的新功能。我们首先在肝癌细胞中证明氧化应激增加SOD1入核；预实验发现SOD1具有转录激活功能。故提出SOD1调控氧化应激相关基因的转录以抑制肝癌发生发展的假设。本项目将致力于：1）验证SOD1的DNA结合域，转录激活域和调控的下游靶基因；2）构建稳定过表达SOD1-TAD突变的稳定细胞株，在体内和体外实验中探究SOD1作为转录因子在肝癌发生发展中的作用；在临床样本中明确其及靶基因在临床中的作用和意义；3）探讨SOD1调控转录的机制。本项目的完成将首次揭示超氧化物歧化酶SOD1作为氧化应激转录因子在肝癌发生中的作用和临床意义，为预防肝癌发生和寻找肝癌的分子治疗靶点提供科学依据。

在前期研究的基础上，我们通过GAL4-SOD1 荧光素酶系统证实了SOD1的16-23Aa为其转录激活结构域；通过ChIP-seq检测到了SOD1结合的下游靶基因的DNA；同时在体外通过EMSA证实了SOD1能够与DNA结合。接着，我们采用GESA分析TCGA数据，KEGG 通路分析ChIP-seq数据均表明SOD1调控脂肪酸代谢途径，同时我们在构建的稳定过表达野生型的SOD1和核定位的SOD1以及敲降SOD1的肝癌细胞系里也证实了SOD1通过调控SREBP1和SREBP2的表达从而调控肝组织的脂肪酸代谢途径相关基因的表达。同时我们在上述构建的肝癌稳定细胞系中对细胞核内的SOD1作为转录因子的生物学功能进行，结果表明细胞核内的SOD1作为转录因子抑制细胞的增殖，克隆形成和迁移能力，而敲降SOD1则促进细胞的这些功能。在体内，我们用裸鼠移植瘤实验证实细胞核内SOD1抑制肿瘤细胞的增殖和生长；根据文献报道，AKT水动力小鼠模型是通过脂肪代谢异常促进肝细胞肿瘤发生，我们联合AKT和细胞核内定位的SOD1注射表明细胞核内定位的SOD1通过减少脂肪滴的形成来抑制肿瘤的发生；在肝癌病人的临床样本中，我们采用定量PCR检测SOD1在肝癌病人癌组织和配对癌旁组织中mRNA水平的表达，发现SOD1 mRNA水平的表达在癌组织内显著下调。采用免疫组化检测SOD1在肝癌组织和癌旁组织蛋白水平的表达情况，发现SOD1总蛋白和定位在细胞核内的在肝癌组织内低表达，且细胞核内的SOD1低表达与患者预后较差相关并且细胞核内SOD1蛋白表达水平是肝癌患者的独立预后因子。根据文献报道在ALS模型中，SOD1调控细胞核质转运，我们通过BiFC鉴定到SOD1可以与RAN相互作用，并被转运进入细胞核。因此，我们明确了细胞核内SOD1可以作为转录因子抑制肝癌的进展，并阐明了其作用机制，完成了本项目的研究计划和研究目标。这些研究结果目前已经成文,尽快就能投稿发表一篇高水平论文。