莪术愈创木烷型倍半萜化合物调节血管内皮细胞/平滑肌细胞增殖迁移的分子机制研究

Zedoary essential components involve in suppressing vascular smooth muscle cell(VSMC)proliferation, facilitating vascular endothelial cell(VETC) coverage,inhibiting platelet aggregation and attenuating inflamatory recation pleiotropic pharmacological effect. Our previous study found Nano-micropore stent eluting zedoary essential components (zedoary guaiane sesquiterpenes compounds，ZGSC) was not inferior to sirolimus eluting stent on inhibition of neointima proliferation and promotion endothelial coverage.The potential mechanism concern that ZGSC regulate VSMC proliferation cycle, facilitate vascular endothelialization mediated by inflammatory factors. The eNOS/Cav-1 gene is a pivotal signal pathway on vascular endothelia protection and reendothelialization.Data is unavailable about relation of incremental expression of eNOS mediated by Cav-1 and restenosis /reendothelialization mediated by ZGSC. To verify the hypothesis, current experiments utilizing mice VETC and VSMC model in vitro to explore ZGSC action targets on VSMC cycle of proliferation, migration and apoptosis. Moreover, to probe the key mechanism of ZGSC on eNOS/Cav-1 signal pathway by Cav-1 and eNOS gene silence model in vitro utilizing aortic endothelial cell culture to elucidate the mechanism of ZGSC on vascular endothelia signal pathway and VSMC proliferation cycle.

莪术提取物具有抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、抑制炎症反应、促进血管内皮细胞（VETC）修复等作用。前期研究表明莪术组分（莪术愈创木烷型倍半萜化合物，ZGSC）支架在抑制血管内再狭窄、血管再内皮化方面优于雷帕霉素支架，机制涉及调节VSMC增殖周期，减轻炎症反应等方面。内皮一氧化氮合酶/小凹蛋白-1(eNOS/Cav-1)是内皮保护及再内皮化重要信号通路，莪术组分支架抑制血管内再狭窄、促进血管再内皮化的机理是否与Cav-1介导的eNOS表达增加相关，尚缺少研究。针对这一问题，本研究用离体培养大鼠VSMC及VETC模型，研究ZGSC对VSMC/VETC增殖、迁移、凋亡的影响,验证ZGSC调节VSMC增殖周期的药理效应；以cav-1静默基因和eNOS静默基因结合，观察其对内皮信号eNOS/Cav-1表达影响，阐明ZGSC抑制VSMC增殖、促进内皮化的分子机制。为其临床转化应用提供实验依据。

药物洗脱支架引起的血管内皮修复延迟，是导致支架血栓、支架再狭窄等主要不良心血管事件（Major adverse cardiovascular events，MACE）的一个关键病理环节。因此，单纯抑制血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖，不仅未能解决介入后血管再狭窄的问题，且有增加MACE的风险。如何抑制VSMC增殖，又能促进血管内皮修复，是目前介入研究领域的一个难点。莪术主要成分具有抗氧化应激、抗炎症反应、减缓动脉粥样硬化发生发展的作用。莪术愈创木烷型倍半萜化合物（ZGS）是中药莪术中的重要活性成分。课题组前期研究发现，在小型猪血管损伤模型中，ZGS支架可促进支架梁包埋，减轻内膜增生，但是具体的作用机制尚未清楚。因此，本论文围绕ZGS对血管内皮细胞及VSMC的作用进行研究。.研究一 观察ZGS对氧化应激（H2O2）诱导内皮细胞损伤的作用。结果：（1）给予ZGS（5、10、20和40ug/mL）作用24 h，ZGS剂量依赖性地增加H2O2抑制地HUVECs迁移、减少活性氧产生；（2）ZGS下调H2O2诱导的Cav-1表达，增加eNOS磷酸化（P-eNOS，Ser1177）水平（P > 0.05）。给予eNOS抑制剂L-NAME，与ZGS+H2O2组比较，ZGS+H2O2+L-NAME下调P-eNOS水平（P < 0.01）和细胞迁移力（P < 0.01）；分别沉默eNOS和Cav-1蛋白表达，ZGS未能调节H2O2诱导的P-eNOS（P > 0.05）和Cav-1水平（P > 0.05）。（3）与H2O2组比较，ZGS浓度依赖性地上调H2O2诱导的SDF-1α和P-38表达，但尚未改善P-JNK和P-Erk1/2表达。另外，ZGS可增加H2O2介导的Nrf2核转移，增加细胞抗氧化应激能力。.研究二 观察ZGS对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人冠脉平滑肌细胞（HCSMCs）表型转化、增殖迁移的作用。结果表明：（1）与TNF-α组比较，ZGS维持HCSMCs“谷峰状”，抑制HCSMCs增殖（G0/G1期）和迁移；（2）与TNF-α组比较，TNF-α+ZGS上调收缩蛋白SMH-HMC和calponin表达，下调合成蛋白S100A4表达，抑制HCSMCs表型转化；（3）ZGS上调TNF-α诱导的P-Cav-1表达，下