循环microRNA-21通过靶基因PTEN参与多发性硬化发病机制的研究

本项目拟在前期工作和预实验的基础上，发现循环miR-21可能通过靶基因PTEN参与了多发性硬化发病的分子机制，因此我们提出假设：即miR-21的表达上调导致PTEN的低表达，低表达的PTEN可导致PI3K和Akt的过度活化，从而使IL-23表达增加，高表达的IL-23可通过诱导、分化Thl7细胞产生IL-17导致MS发病。为此我们拟在EAE动物模型上验证该机制，同时在病情的不同时间点检测体液中miR-21的表达，观察其与MS病情的关系，争取使循环miR-21能够作为MS无创诊断和预后的生物标志物。然后我们拟在阐明miR-21参与MS发病的分子机制后，利用EAE模型对可通过血脑屏障的、以活化免疫细胞为靶向的双靶向纳米材料介导miR-21反义寡核苷酸沉默治疗MS，并对其可行性及生物安全性进行初步评估，为MS的基因治疗带来新的希望和突破，也将为寻找MS的分子标志物和基因治疗的新靶点奠定理论基础。

一、背景：.本项目前期工作发现循环miR-21可能通过靶基因PTEN参与了多发性硬化发病的分子机制，因此我们提出假设：即miR-21的表达上调导致PTEN的低表达，低表达的PTEN可导致 PI3K 和Akt的过度活化，从而使IL-23表达增加，高表达的IL-23可通过诱导、分化Th17细胞产生IL-17导致MS发病。.二、方向和主要内容：.我们拟在EAE动物模型上验证该机制，同时在病情的不同时间点检测体液中miR-21的表达，观察其与MS病情的关系，争取使循环miR-21能够作为MS无创诊断和预后的生物标志物。然后我们拟在阐明miR-21参与MS发病的分子机制后，利用EAE模型对可通过血脑屏障的、以活化免疫细胞为靶向的双靶向纳米材料介导miR-21反义寡核苷酸沉默治疗MS，并对其可行性及生物安全性进行初步评估，为MS的基因治疗带来新的希望和突破。.三、重要结果：.（1）制备并检测了多种新型纳米材料，发现新型纳米材料β-CD-(D3)7对神经母瘤细胞的毒性较小，转染效果较好。其他多种材料因转染效率差而未进行进一步检测。.（2）初步检测了miR-21在部分MS病人的血液中的表达及相关性；.（3）完成了多种非病毒载体介导microRNA转染炎症相关细胞的体外实验研究；.（4）完成了microRNA-21表达变化对THP-1细胞炎症反应的相关研究。.四、关键数据及其科学意义：.1、完成了纳米材料β-CD-(D3)7对神经母瘤细胞的毒性及转染效果的检测：.β-CD-(D3)7和DNA在N/P比为10时就能完全结合。当材料浓度大于50ug/uL时，HEK293细胞活力分别为50%（β-CD-(D3)7）和17%（PAMAM）；SH-SY5Y细胞的活力分别为30%（β-CD-(D3)7）和16%（PAMAM）。在HEK293细胞系中，当N/P比=20时，β-CD-(D3)7的转染效率为45%，PAMAM为23%；在SH-SY5Y细胞系中，β-CD-(D3)7的转染效率为19%，PAMAM为7%。β-CD-(D3)7具有很强的DNA负载能力，对神经系统细胞转染效率高，同时细胞毒性较低，可作为新的神经系统细胞基因载体，应用于下一步的体内实验。.2、研究了miR-21在神经免疫中对TNF-α细胞因子的调控作用：.（1）过表达miR-21的THP-1细胞TNF-α的基因相对表达量和释放浓