基于转录组学和差异蛋白组学关联解析火鸡组织滴虫致弱的分子机制

Histomonosis is one of the most important diseases of gallinaceous birds caused by the flagellated protozoon Histomonas meleagridis. With the increasing demand for consumer protection recently, it poses a serious threat to the poultry industry due to the ban of effective prophylactics and therapeutics. Attempts to protect birds with cultured and attenuated histomonads indicated the possibility of vaccination. However, the virulence factors and attenuation mechanism of histomonads need to be further investigated at molecular level. In our previous studies, a field virulent strain of histomonads has been successfully cloned, propagated, and attenuated in vitro, which induced protective immunity in chickens. In the present project, the specific genes associated with attenuation between virulent histomonads and attenuated histomonads will be analyzed by comparative transcriptomics. Specific proteins associated with attenuation also will be identified by differential proteomic analysis. Then the virulence factors of histomonads and the molecular mechanism of attenuation will be illuminated by association analysis at genic and proteic level simultaneously. Finally the main virulence factor will be further verified by gene knockout and animal inoculation test. Results of this project can provide some targets and implications for vaccine and drug development against histomonosis.

组织滴虫病是由火鸡组织滴虫引起的一种禽类原虫病。长期以来，该病的防治主要依靠药物。近年来，因公共卫生要求，药物已受到限制或禁止，使得该病防治陷入困境。传代致弱活疫苗免疫预防是控制该病最有效方法，但虫体的毒力因子构成及致弱的分子机制尚未明确。本课题组前期已经成功建立了火鸡组织滴虫体外单克隆培养技术，获得了鸡源强毒虫株，并通过体外连续传代成功获得了具有良好免疫保护作用的致弱虫株。在此基础上，本研究拟通过强毒株和致弱株的转录组学和差异蛋白组学关联分析，筛选和挖掘致弱过程中两者差异表达的基因和蛋白，鉴定毒力因子，并通过基因敲除和体内感染试验对主要毒力因子予以验证，解析虫体致弱的分子机制。研究结果既能为活疫苗应用提供理论依据，又能为新型药物和疫苗研制提供明确靶点。

火鸡组织滴虫通过体外连续传代培养可使其对宿主的致病力显著下降，但目前对导致其致病力下降的基因及其功能知之甚少。本项目在分离和纯化火鸡组织滴虫JSYZ-D株并对其进行体外连续168次传代的基础上，对其致弱程度及免疫保护效果进行验证，确定其致病力明显减弱并具有一定的免疫保护效果。通过对火鸡组织滴虫D10代强毒株与D168弱毒转录组比较分析，获得了火鸡组织滴虫差异表达基因。差异表达基因经GO功能富集分析和KEGG通路富集分析后，筛选出了与火鸡组织滴虫毒力相关的基因，并进行了qRT-PCR验证。同时通过TMT蛋白组比较，获得了火鸡组织滴虫差异表达蛋白，经GO与KEGG功能富集分析后，筛选出与火鸡组织滴虫毒力相关蛋白，并通过PRM方法进行了验证。联合分析后选择了差异表达蛋白的基因进行克隆、表达与功能研究。转录组共获得38.47Gb的数据，组装后得到35914个Unigene，其中有1160个共有差异基因，与致弱株相比，共计188个上调表达基因，972个下调表达基因。蛋白组共获得3849个蛋白信息，其中3494个蛋白可定量，与致弱株相比，其中上调蛋白192个，下调蛋白553个。转录组学和蛋白组学联合分析后确定虫体毒力因子主要包括肌动蛋白、组蛋白乙酰转移酶KAT2A、220kDa激酶D相互作用底物等62个基因和蛋白。克隆、表达了毒力因子相关的HmACTN1、HmME1基因，免疫荧光定位显示这些基因定位在火鸡组织滴虫胞质内，证明其在强毒株虫体中确实大量存在，弱毒株中分布较少，重组蛋白rHmα-actinin1免疫雏鸡后能产生一定的免疫保护力。本研究结果初步阐明了火鸡组织滴虫致弱分子机制和毒力因子，为研发火鸡组织滴虫亚单位疫苗提供了候选基因。