Hfq介导淋球菌对头孢曲松耐药的作用机制研究

Ceftriaxone is currently the only first-line treatment drug of all kinds of gonorrhoea, and the emergence of ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae reported abroad recently caused new public panic, then the studies of the drug-resistant mechanisms became the latest hotspot in this field. Abroad, recent studies have found that the mechanisms of gonorrhoeae resistant to ceftriaxone differ from other bacteria completely, mosaic penA mutation might be one of the important mechanisms, but there are other unknown mechanisms. We began to study the mechanisms of ceftriaxone resistance in gonorrhoeae in 2002, and the recent results of differential analysis of genome and transcriptome between the pre- and post-induced strain indicated that except of penA mutation in post-induced ceftriaxone-resistant gonorrhoeae, the multi-locus mutations and increased gene expression of hfq, an encoding gene of a highly conserved pleiotropically acting RNA-binding protein, may be more important resistance mechanisms. We are planning to apply the site-directed mutagenesis, gene knockout and siHybrids techniques to confirm the function of hfq in ceftriaxone-resistant gonorrhoeae. This study could further elucidate the molecular mechanisms of gonorrhoeae resistant to ceftriaxone, and provide laboratory evidence for the new targets of drugs and the measures of gonorrhoea treatment.

头孢曲松是目前治疗各种淋病的唯一一种一线药物，但近年来陆续在国外报道的耐头孢曲松淋球菌引起了新的恐慌，对其耐药机制的研究成为了该领域最新的热点。国外新近的研究发现，淋球菌耐头孢曲松的机制完全与其它细菌不同，镶嵌型penA的突变可能为其中的重要机制之一，但还有其它未知的机制。我们从2002年就开始了淋球菌耐头孢曲松机制的研究，刚刚结题的诱导耐药前后全基因组和转录组差异分析的研究表明，体外诱导的耐头孢曲松淋球菌除了有penA基因的突变外，高度保守的具有多向调节活性的RNA结合蛋白编码基因hfq发生多位点突变及其功能表达的上调可能是更重要的耐药机制。我们拟用基因定点突变、基因敲除和siHybrid技术验证该基因在淋球菌耐头孢曲松机制中的作用。本研究将为进一步阐明淋球菌耐头孢曲松的分子机制，找到新的药物作用靶点和防治措施提供实验室依据。

头孢曲松耐药淋球菌的出现威胁到全球公共健康并引起了全球范围的广泛关注。然而迄今为止，淋球菌对头孢曲松耐药的分子机制仍未被完全阐明。在前期研究中，为探索淋球菌对头孢曲松耐药的潜在耐药基因以及抗菌药物选择压力在耐药产生过程中的作用，我们运用头孢曲松次抑菌浓度法体外诱导WHO标准株A~E和临床株GD1337（本研究增加诱导），选择诱导后对头孢曲松耐药的菌株（WHO-D）。通过对已知的与头孢曲松耐药相关的基因进行PCR扩增及测序，我们仅发现penA基因出现了A501V突变。尽管如此，诱导前后耐药菌株的基因组和转录组差异分析发现了多个突变基因（ftsX、phbP、farB和hfq）以及表达上调（ABC transporters、farB、tfq、hfq和exbB）和下调基因（pilMNQ）。原核生物中具有多向转录后调控活性的Hfq编码基因发生突变并且表达增强，提示了耐药现象的转录后调控机制。.在本研究中，我们进一步体外合成了淋球菌penA-H041基因作为转化实验的阳性对照，并克隆纯化了诱导后对头孢曲松耐药淋球菌WHO-D株的突变基因penA、ftsX、hfq、farB和phbp。通过将这些突变基因转化淋球菌受体菌株ATCC43069、诱导前对头孢曲松敏感的WHO-D株和GD1372株，我们发现含有T31P突变的ftsX基因可使受体菌株对头孢曲松的MIC值分别升高13.3、6.7和3.3倍，含有A501V突变的penA基因可使受体菌株对头孢曲松的MIC值分别升高5.3、3.3和2.0倍，而发生突变的hfq、farB和phbp基因不能引起受体菌株对头孢曲松MIC值的升高。通过对诱导过程中突变基因的监测，我们发现淋球菌hfq突变在淋球菌传代培养第19次出现，farB和phbp基因突变在第33次出现，penA基因突变在第47次出现，ftsX基因突变在第86次出现。诱导耐药中我们发现，淋球菌对头孢曲松产生耐药同时出现交叉耐药和生化代谢率升高，并表现出生长时间延长和PilMNlQ表达下调影响菌毛形成的适应性缺陷。此外，实验中无法获得淋球菌penA基因敲除后的缺失体，提示penA基因很可能是淋球菌生存的关键基因。我们的研究表明，抗菌药物选择压力可诱导头孢曲松耐药淋球菌的出现，其机制主要是由penA和ABC transporter的ftsX亚基突变所介导，hfq基因表达上调起重要作用。