多臂两亲性嵌合肽的设计、合成及基因/药物共传递

The carriers of gene/drug co-delivery, mostly with sole function，cannot effectively across physiological barriers inside and outside the cells, leading to low gene transfection efficiency and short expression time. Asymmetric Y- or star-shaped multi-armed amphiphilic chimeric peptides (MACPs) will be synthesized via the solid phase synthesis (SPS) technique and used as gene/drug co-delivery carriers. As the hydrophobic end of MACPs, alkyl side chains will entrap the hydrophobic drug and enhance gene transfection efficiency. And the hydrophilic end of MACPs, peptide sequences with the functions of tumor targeting, transmembrane, endosomal escape and nuclear localization, will condense DNA and improve the ability of carriers to overcome the physiological barriers. Through altering the length and arrangement of alkyl side chain and peptide fragments, the stability, the DNA condensation ability, the drug-loaded capacity and the self-assembly behavior of the MACPs will be adjusted. Based on the synergistic action of alkyl side chains and peptide sequences, the functions of the assembly MACPs such as cell internalization, cytotoxicity, gene expression and synergistic inhibition against cancer cells proliferation will be extensively investigated. The impact of the secondary structure on the MACPs self-assembly stability and delivery performance will be studied. The preferred assembly will be used for exploring the performance of gene/drug co-delivery and anti-tumor effects in vivo. The research of this topic will provide new ideal co-delivery carriers for the combination therapy of cancer.

目前基因/药物共传递载体由于功能单一，不能有效跨越细胞内外生理屏障，导致体内基因转染效率低和表达时间短。本课题采用固相合成法，制备二臂Y型或三臂星型多臂两亲性嵌合肽（MACPs），用于基因/药物的共传递；MACPs的疏水端为烷基链，用于包载疏水药物和提高基因转染效率，亲水端为具有肿瘤靶向、跨膜、内涵体逃逸和核定位功能的各种功能肽序列，用于复合DNA，提高载体跨越细胞内外生理屏障的能力；调整功能肽序列的长短、烷基链的长短和数目，比较MACPs的自组装性能和基因/药物负载能力；以烷基链和各功能肽的协同作用，深入研究MACPs的细胞毒性、细胞内吞、基因转染、药物控释以及抑制癌细胞生长的基因/药物协同作用；探讨MACPs二级结构的变化对组装体稳定性和基因传递性能的影响；筛选出性能最佳的MACPs，研究MACPs的体内基因/药物传递性能和抗肿瘤效果。本课题的实施将为癌症的联合疗法提供理想的载体。

理想的载体系统是实现肿瘤化学疗法和基因疗法高效安全的关键所在。本项目以多肽作为载体材料，设计合成了多条两亲性多肽序列，研究了它们的自组装性能和药物、基因传递效果。首先，我们设计合成了三条阳离子多肽KKTNVTLSKKRKRR（Pep1）、、C18KKTNVTLSKKRKRR（Pep2）、RRKRKKK（C18）KKRKRR（Pep3），研究对比了它们在基因传递方面的性质。与未经疏水烷基链修饰的多肽（Pep1）相比，Pep2和Pep3可以在较低的复合比下与DNA有效复合。体外基因转染实验表明，与多肽Pep1相比，Pep2和Pep3可介导更为高效的基因表达水平。通过圆二色谱测试，发现Pep2的二级结构主要以α-螺旋为主， Pep3主要是无规卷曲。推测Pep2转染效率高的原因可能是Pep2的α-螺旋的空间构象促进了穿膜能力。选择功能化的SH-PEG-COOH作为连接物，将三条多肽链与金纳米通过金硫键和酰胺键共价连接，得到多肽-金纳米载体系统AuNPs-PEG-Pep1、AuNPs-PEG-Pep2、AuNPs-PEG-Pep3。Zeta电位和琼脂糖凝胶电泳结果表明，AuNPs-PEG-Pep2、AuNPs-PEG-Pep3在复合比为1时显示正电性，能够有效复合DNA，而AuNPs-PEG-Pep1在复合比2时有效复合DNA。基因转染的结果发现AuNPs-PEG-Pep1、AuNPs-PEG-Pep2、AuNPs-PEG-Pep3对DNA的最佳转染效率分别是28.94%、72.18%和48.6%。三者相比，AuNPs-PEG-Pep2的转染效率最佳，接近阳性对照—lipofectamine2000。通过MTT实验，证明了多肽-金纳米颗粒具有较好的生物相容性，有望应用于临床上的基因治疗。另外，我们设计并制备了三种新型的两亲性多肽VVVVVVKKGRGDS-OH（AP1）、C11H23-CO-NH-KKGRGDS-OH（AP2）、FAFAFAKKGRGDS（AP3）。表明多肽AP1的自组装行为具有明显的酸敏感特征。CD和FT-IR的测试结果进一步证实了多肽AP1在中性和酸性条件下二级结构有所变化。AP1、AP2和AP3在酸性条件下自组装行为的不同提示，调控两亲性多肽的疏水端组成有可能是调控多肽自组装性能的有效手段。AP1组装体有望成为理想的pH响应性载体材料。