药物转运体基因ABCB1启动子核苷酸多态性结合DNA甲基化对难治性癫痫的影响及其分子机制研究

Antiepileptic drug resistance is a difficult problem in the treatment of epilepsy. The overexpression of drug transporters (also called P-glycoprotein, encoded by the ABCB1 gene) in the blood-brain barrier and the brain may be one of the important mechanisms for antiepileptic drug resistance. The mechanism of drug resistance cannot fully account for the mutation of ABCB1 gene. Is there any other epigenetic changes could confer pharmacoresistance in epilepsy? Our previous study indicated a CpG hypomethylation trend in the promoter region of ABCB1 in the resection brain tissue of the patients with drug resistance epilepsy. Herein, we propose, that DNA methylation in the promoter region of ABCB1 gene may be a new molecular mechanism on the regulation of gene expression. In order to explore the mechanism of ABCB1 genetic polymorphisms and DNA methylation regulating gene expression, and the impact of ABCB1 promoter methylation on antiepileptic drug efficacy, in the present study, the status of genetic polymorphisms and CpG island methylation in ABCB1 gene promoter was evaluated by HRM, methylation-specific PCR analysis and pyrosequencing in astrocytes, chronic epileptic rat and the patients with drug-resistant epilepsy, respectively. We expect to elucidate this new molecular mechanism of antiepileptic drug resistance and develop new biomarkers and therapeutic target.

癫痫药物耐药是癫痫治疗领域的难题，药物转运体（又称P-糖蛋白，由ABCB1基因编码）在血脑屏障上和脑实质内过表达可能是药物难治性癫痫发生的重要机制之一。ABCB1基因突变仍不能完全解释抗癫痫药物耐药的现象，是否有其他遗传学外的信息在调控耐药发生呢？在耐药性癫痫患者手术切除的少量脑组织样本中，我们发现ABCB1基因启动子区CpG岛有去甲基化的改变趋势。由此，我们提出假设：药物转运体ABCB1启动子甲基化修饰对基因表达调控可能是耐药性癫痫的另一种新的分子机制。为探索ABCB1启动子区基因多态性和甲基化修饰对基因表达的调控机制，及对抗癫痫药物耐药的影响，本课题以星形胶质细胞、慢性癫痫大鼠及癫痫患者为研究对象，用HRM法、甲基特异性PCR和焦磷酸测序检测ABCB1启动子基因多态性和CpG岛位点的甲基化程度，期望从崭新的角度阐明抗癫痫药物耐药的分子机制和发展新的生物标志物。

难治性癫痫是癫痫治疗领域的难题之一，约占癫痫病人的20%～30%，目前作用机制仍不明确。过去的研究也发现外排转运体ABCB1的过表达可能是导致耐药的重要机制，因其可以降低病灶中药物的有效浓度。但ABCB1过表达的分子机制尚不明确，可能存在内源性或外源性的诱导表达。因此，我们的研究在构建血脑屏障的细胞模型，利用抗癫痫药物诱导ABCB1的表达，但并未得出有力的证据证明ABCB1的过表达是由抗癫痫药物诱导产生的。内源性表达中甲基化机制在过去的研究中也发现与耐药性癫痫存在紧密联系，随后我们通过病人脑组织中免疫组化中发现TET2去甲基化酶的表达异常升高，可能成为耐药性癫痫患者潜在的生物标记物。为了验证TET2与耐药性癫痫的关系，我们提出假设，TET2可以调控ABCB1的表达，并利用hCMEC模拟血脑屏障，来敲除验证TET2的功能，我们的通过荧光定量PCR，免疫印迹法，罗丹明123分别验证了TET2敲除后ABCB1 mRNA，蛋白以及功能等水平的高低，发现TET2确实对ABCB1存在正向调控机制。在敲低TET2表达后，ABCB1的表达水平以及功能都出现了趋势性的下降，但TET2对ABCB1的具体调控机制尚不明确。. 总之，我们的实验初步证明了TET2在耐药性癫痫病灶中存在高表达，且TET2在血脑屏障模型中能调控ABCB1的表达，因此，初步证据证明了TET2可能是耐药性的重要的生物标记物，可作为耐药性癫痫诊断和治疗潜在的特异性靶标，但其对ABCB1的甲基化以及调控机制尚需进一步实验的验证和探讨。受本基金资助发表在国际学术期刊发表SCI论文2篇，中文核心期刊1篇，还有至少2篇论文待发表。因此可以说在基金委的资助下，本项目获得了令人满意的结果。