TRIM4泛素化NSP2调控PRRSV复制研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome is an important infectious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), characterized by high fever, high morbidity and high mortality, accompanied by severe respiratory symptoms and reproductive disorders, abortion, stillbirth, mummy tires. Previous proteomic studies have shown that PRRSV NSP2 interacts with TRIM4 protein, but the effect of TRIM4 on PRRSV infection and replication is unknown. In this study, we aim to test the effect of TRIM4 on PRRSV replication with overexpression, siRNA, knockout cells, and explore the mechanism between them, and identify the key interaction domains between PRRSV NSP2 and TRIM4, test the difference between high and low pathogenic strains NSP2 and TRIM4. PRRSV infection experiment in pigs will be taken to study the TRIM4 expression differences with different pathogenic PRRSV in vivo. This project will reveal the mechanism of TRIM4 regulating PRRSV replication at the molecular level, which is of great significance to further elucidate the pathogenic mechanism and virulence of highly pathogenic PRRSV.

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种引起母猪繁殖障碍和各年龄猪呼吸道症状的高度传染性、接触性传染病。前期蛋白质组学研究证明PRRSV NSP2与TRIM4蛋白互相作用，而TRIM4对PRRSV感染与复制影响还是未知。本项目拟利用过表达与siRNA，基因敲除技术研究TRIM4对PRRSV复制影响，并探索其中机制，明确PRRSV NSP2与TRIM4互相作用关键结构域，以及强弱PRRSV毒株NSP2与TRIM4互作差异。同时利用猪体内感染PRRSV试验，研究TRIM4在不同致病力PRRSV感染情况下表达差异以及与毒力相关性。本项目将从分子水平上揭示TRIM4调控PRRSV复制分子机理，对进一步阐明高致病性PRRSV致病机理与毒力具有重要意义。

猪繁殖与呼吸综合征对我国和世界养猪业造成了巨大的经济损失。前期研究表明TRIM4蛋白与PRRSV NSP2蛋白互作，不过TRIM4是否调控PRRSV复制，以及如何与NSP2互作发挥调控作用仍是未知。本项目主要研究TRIM4是否调控PRRSV复制以及TRIM4调控PRRS复制的机制，为疫苗研发以及揭示PRRSV持续感染与免疫逃逸奠定基础。本研究结果表明PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞，TRIM4表达量升高。将PRRSV感染猪，在不同的脏器中，检测TRIM4的表达量变化，结果表明PRRSV 感染后肺脏等脏器中的mRNA表达量升高。与此同时，强弱PRRSV感染细胞与组织发现，强PRRSV毒株激活TRIM4表达量高与弱毒株。将TRIM4过表达在Marc-145细胞，并感染PRRSV，在不同时间点收集细胞上清与沉淀，检测TRIM4过表达对PRRSV复制的影响。结果表明在不同的时间点，上清中加入TRIM4之后，PRRSV滴度有所下降。此外，上清中PRRSV mRNA拷贝数明显下降。设计针对TRIM4的干扰小RNA-TRIM4 siRNA，将该siRNA转染细胞，通过western blot验证TRIM4 siRNA有效抑制TRIM4表达。将该TRIM4 siRNA转染到Marc-145细胞并感染PRRSV，在不同时间点收集细胞上清与沉淀，检测TRIM4 siRNA对PRRSV复制的影响。结果表明上清加入TRIM4 siRNA之后，PRRSV滴度有所升高。此外，上清中PRRSV mRNA拷贝数明显升高。之后将flag标签TRIM4与HA-NSP2共转染293细胞，进行免疫共沉淀，结果表明TRIM4与NSP2互相作用，且互相作用主要位于TRIM4的C端。同时将PRRSV感染Marc-145细胞，进行内源免疫共沉淀，结果进一步表明TRIM4与NSP2互作。免疫共沉淀实验结果表明，加入TRIM4之后，NSP2表面泛素化水平有所升高。将不同剂量的TRIM4与NSP2共转染293细胞，结果表明随着TRIM4剂量的增加，NSP2的表达量下降。同时设置蛋白酶抑制剂MG132对照组，结果表明加入MG132之后，TRIM4无法降解NSP2。以此同时，将泛素分子K48质粒或者K48R，与TRIM4和NSP2共转染细胞，免疫共沉淀结果表明泛素化发生在K48位点，突变之后就不能发生泛素化。