由核酸结构介导的基因编辑工具酶SGN的研究

The current gene editing enzymes are complex and high-cost. The sequence preferences may limit their application. In this research, based on the first-generation structure-guided endonuclease (SGN), we are going to develop a sencond-generation SGN by adding helicase domain and constructing the dimer-SGN. The sencond-generation SGN is DNA sequence independent and can cleave any desired sequence. What’s more, we are going to test the cutting efficiency of the sencond-generation SGN with comparation of current gene editing enzymes both in vivo and in vitro. This project will provide a new way for the development of gene editing enzyme. In theory, the SGN will realize the cutting and identification of any desired target DNA, which may promote the development of gene editing technology and make contribution to the medical and life science.

针对现有基因编辑工具酶设计复杂、成本较高、不能实现对任意靶标DNA进行切割等缺点，本课题在已自主构建第一代结构介导内切酶 (SGN) 的基础上，通过对SGN加入具有解旋功能的功能域，以及由单体变为二聚体的方法，设计出第二代SGN。第二代SGN是一种通过核酸结构介导识别替代现有的核酸序列介导识别，不受靶标DNA序列限制的基因编辑工具。本课题将在体外和体内水平对二代SGN的切割能力进行研究，并同现有基因编辑工具进行比较。本课题为基因编辑工具酶的研发提供了新的研究思路，在理论上实现了在体内和体外水平对任意靶标DNA的识别切割。本课题的成功研究将促进基因编辑技术的发展，为推动医学和生命科学的发展做出贡献。

针对现有基因编辑工具酶不能同时高效编辑任意序列DNA和RNA底物的缺陷，本项目在第一代结构介导基因编辑工具（SGN系统）的基础上，继续改进，进一步提高了切割效率和靶向性，成功开发出一种具有我国自主知识产权无序列限制的第二代结构介导基因编辑工具——HpSGN系统。HpSGN系统是在原有SGN系统的基础上，引入了发卡探针（hpDNA），由FEN1蛋白和发卡探针（hpDNA）共同组成的基因编辑系统。FEN1蛋白能识别hpDNA的发卡结构，形成FEN1-hpDNA二元复合物；该二元复合物将由hpDNA上的指引序列指引，靶向结合到目标靶点上，FEN1蛋白的内切酶活性可对靶位点进行切割；而在FEN1蛋白的5’外切酶活性作用下，靶位点上因切割而产生的nick缺口会向下游方向扩大，从而产生大片段缺失突变，避免微小突变造成基因沉默不完全的可能。经典的CRISPR系统自2012年问世以来，掀起了基因编辑领域的一场技术革命，仅问世8年后，就获得了2020年诺贝尔化学奖。但是CRISPR系统在实际使用方面仍有一些不便之处的，针对这些问题，本课题组设计了HpSGN系统，相较于CRISPR，其具有以下几个特点：（1）具备同时切割DNA和RNA靶标的功能。CRISPR系统中，Cas9/12蛋白可用于DNA靶标的切割，Cas13蛋白可用于RNA靶标的切割，尚没有一种Cas蛋白被报道可同时编辑细胞的基因组DNA和RNA。本项目研发的HpSGN系统，被验证可以既可以编辑基因组DNA，也可以用于编辑mRNA，未来还可以用于lncRNA、miRNA、cirRNA、mtDNA等编辑，并具有开发为抗DNA/RNA病毒药物的前景。（2）不受靶标序列限制。CRISPR系统中，Cas蛋白要求与sgRNA探针结合的靶标序列中含有PAM序列，即要求靶标序列中的一段有固定的碱基搭配。本项目研发的HpSGN系统，对靶标的序列没有限制，理论上可以在基因组和转录组上切割任何位置的靶基因。（3）结构简洁、分子量和体积较小，利于递送。CRISPR系统中，Cas蛋白的分子量约为200-100 kDa，在细胞内使用常见的腺病毒进行递送过程中，由于还有供体DNA，较大的分子量和体积的Cas蛋白是不利于递送的。而本项目研发的HpSGN系统，其FEN1只有35 kDa，更利于胞内运送。