赖氨酰氧化酶在心肌纤维化过程中的变化及作用机制

In response to persistent injury, irreversible and maladaptive changes of the network occur, leading to myocardial fibrosis. Myocardial fibrosis is mostly characterized by the excessive interstitial and perivascular deposition of collagen fibers. It is now becoming apparent that myocardial fibrosis directly contributes to myocardial remodeling and prevents the regeneration of myocardial tissue in damaged area. The enzyme lysyl oxidase (LOX) is a copper-dependent extracellular enzyme that catalyzes lysine-derived cross-links in collagen and elastin. However, evidence from animal experimental and clinical studies shows that the increased collagen deposition was accompanied by increased expression of LOX and decreased Cu levels in the heart after ischemic damage. This study will be conducted to discover the relationship between Cu levels, LOX expression and/or activity, and myocardial fibrosis in the heart, as well as the mechanisms of myocardial fibrosis caused by LOX. The purpose of this study is to develop a possible way to promote the degradation of collagen in the scar and regeneration of cardiomyocytes after myocardial ischemia, preparing for the development of new therapies of ischemic myocardial injury.

心肌纤维化是持续性和（或）反复加重的心肌损伤所产生的结果，是心室重构持续发展和难以逆转的重要原因。赖氨酰氧化酶能催化细胞外基质蛋白交联，在心肌纤维化过程中起到关键的调控作用。铜是赖氨酰氧化酶发挥作用必不可少的金属辅因子。临床研究报道，以及我们动物实验的结果都证实了心肌缺血损伤后，心肌组织中铜的含量明显下降，赖氨酰氧化酶蛋白含量明显升高，心肌纤维化明显加重的现象。因此，本课题提出通过改变铜的含量调节赖氨酰氧化酶活性这条途径来逆转心肌纤维化过程的假设。本研究的目标是：（1）揭示在缺血心脏中，心肌组织中赖氨酰氧化酶蛋白含量与活性的变化情况；（2）阐明心肌组织中铜含量的变化与赖氨酰氧化酶蛋白含量和活性调节之间的相关性；（3）探索赖氨酰氧化酶的变化在心肌纤维化过程中的关键作用，为最终达到"增加心脏中铜的含量来调节赖氨酰氧化酶的表达，促进心肌纤维化逆转，治疗心肌组织损伤"的目标提供相关的理论基础。

心肌梗死后的心肌纤维化严重损害了心脏的收缩和舒张功能，并导致心衰的发生。赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）是可以促进I、III型胶原的交联，并沉积在细胞外基质中形成纤维化的瘢痕。LOX发挥活性离不开铜。当心脏遭受缺血缺氧损伤时，铜从心脏中流失出来，并伴随着心肌纤维化的发生。当铜含量减少时，LOX会不会受到影响呢？我们通过qRT-PCR，Western Blot和免疫组化的方法观察到，心脏梗死区LOX的蛋白水平是显著增加的。同时，用试剂盒的方法检测观察到，LOX的活性也是显著增加的。说明在心肌梗死中，虽然铜的总量减少了，但是分布可能发生改变而使LOX的蛋白和活性增加，促进了心肌纤维化。为了探究LOX在心肌纤维化中的作用，我们应用Cre-loxP系统构建了心肌特异性敲除LOX的小鼠，再进行左冠状动脉前降支结扎后观察心肌纤维化的形成情况。为了探究在心肌梗死中是哪一种关键蛋白将铜传递给LOX使其活性增加，我们构建了原代培养的大鼠成纤维细胞，通过Co-IP检测与LOX有直接作用的铜传递蛋白，并且通过siRNA的方法沉默相关蛋白后，观察LOX的活性会不会发生改变。同时，我们对心脏进行补铜，观察到铜治疗后，梗死范围缩小，心功能回复。为了进一步探究铜逆转心肌纤维化的机制，我们用免疫荧光的方法检测了成纤维细胞的变化。我们观察到，铜治疗后，激活的成纤维细胞，也就是肌成纤维细胞的数量减少，同时这些成纤维细胞分泌的胶原蛋白和LOX均下降。因此，铜可能通过调控成纤维细胞的状态来逆转心肌纤维化。