ROP潜在效应物OsMY1在水稻幼穗分化中的功能研究

As a molecular switch in the signaling pathway, plant ROP is involved in a variety of important growth and development events by regulating the dynamics of actin cytoskeleton, but the functional mechanism has not yet fully understood. A putative ROP effector OsMY1 was isolated as a partner of OsRacD. In this study, the function of OsMY1 in rice panicle development and fertility control will be identified by CRISPR and overexpression technique; its role in RAC/ROP signaling pathway will be confirmed by RNA-seq technique; its effect on actin cytoskeleton assembly will be characterized by immunofluorescence staining; the relationship between OsMY1 and vesicle transport will be detected by the transmission electron microscopy. The full-length cDNA sequence of OsMY1 will be isolated by RACE. The expression regulation mechanism of the gene will be revealed by subcellular localization, Western Blot and promoter analysis combined with RNA in situ hybridization histochemistry. The function of OsMY1 in relaying the ROP signal to actin skeleton dynamics can be addressed, as well as the molecular mechanism and function of OsMY1 in rice panicle development and fertility control. This study has important scientific significance in the study of the regulation mechanism of rice panicle development. Meanwhile, it also provides genetic resources and theoretical basis for crop genetic improvement in agricultural production.

ROP蛋白作为信号通路中的开关分子，通过调节肌动蛋白细胞骨架的动态变化，参与植物生长发育调控，但是其作用机制尚未完全解析。本项目拟在已经分离的水稻ROP蛋白OsRacD潜在效应物编码基因OsMY1的基础上，拟采用CRISPR和过表达技术明确该基因在水稻幼穗发育和育性控制中的功能；采用RNA-seq技术、免疫荧光染色和透射电镜技术确定该基因沉默对幼穗组织中肌动蛋白细胞骨架组装和膜泡运输的影响，确定OsMY1在ROP信号通路中的地位；采用RACE技术克隆OsMY1全长cDNA，亚细胞定位、Western Blot、启动子分析结合RNA组织原位杂交分析鉴定该基因的表达特征，旨在阐明OsMY1在联系ROP与肌动蛋白细胞骨架动态调控中的作用，以及该基因在水稻幼穗发育和育性控制中的分子作用机制。本研究在水稻幼穗发育的调控机理的研究方面有重要的科学意义，为农业生产中的作物遗传改良提供基因资源和理论基础。

ROP蛋白是参与植物生长发育调控信号通路中重要的开关分子，主要通过两个已知的 ROP下游效应蛋白 RIC 和ICR/RIP传递信号。本项目基于以水稻ROP蛋白OsRacD潜在效应物编码基因OsMY1为研究对象，研究该基因在水稻中的功能，取得了以下主要研究成果：（1）克隆了水稻中两个潜在的RIP蛋白基因：OsMY1和OsMY2，所编码的蛋白皆具有保守的卷曲螺旋结构域（CC结构域，该基序存在于许多动物Rho蛋白效应物中）和一个植物ROP相互作用蛋白特有的基序。分子进化树显示，两者与拟南芥中AtICR和AtRIP亲缘关系较近。亚细胞定位表明OsMY1蛋白定位在细胞核中；（2）发现OsMY1-RNAi转基因水稻植株株高的降低和GA有关。本项目的研究结果显示，外源施加GA能恢复OsMY1-RNAi植株的表型，表明OsMY1-RNAi植株变矮的原因可能是由于内源GA缺乏引起的，即OsMY1 基因可能参与调节 GA 合成途径中的多个关键基因表达，并抑制 GA 信号的传导，进而调节水稻株高；（3）通过对转基因水稻植株的农艺学统计发现：与野生型水稻相比，OsMY1-Cas9和OsMY1-RNAi水稻并未表现出显著的差异，但种子粒长皆变长；OsMY2-Cas9和OE-OsMY1的转基因植株农艺学性状与野生型相比，无较大变化；双突OsMY1/OsMY2因转基因植株数量少，不具有统计学意义。该项目解析了OsMY1能通过GA影响水稻的株高，并影响粒型，为农业生产中的作物遗传改良提供了一定的理论基础和科学依据。上述结果仅仅窥视了OsMY1功能的冰山一角，如OsMY1和GA是如何相互影响发挥作用的、OsMY1和OsMY2两者之间是否存在遗传补偿效应等等，这些都将在我们后续研究计划中。