基于光透明的稳定颅窗实施穿颅活体皮层神经光学成像研究

With the advent of two-photon microscopy and transgenic mice expressing fluorescent proteins, dendritic spine, the subcellular structure of neuron can now be imaged in the living cerebral cortex. Recent studies with this in vivo imaging approach have begun to provide important insights into the plasticity of neural circuits in the intact brain. However, the turbid skull limits the penetration of light into cortex, and the current cranial windows are not stable. In our project, a switchable and stable cranial window based on optical clearing of skull will be established and be applied to image subcellular structure of neuron in the intact brain. Meanwhile, the safety, the effectiveness and the validity of our cranial window will be investigated. With this window, in vivo optical imaging approach will be established to observe cortical dendritic spine with high resolution. Through monitoring long-term and short-term changes in activated microglia and astrocytes, and cortical vascular structure and blood flow, the safety of the cranial window will be evaluated. The dynamics of dendritic spine of animals living in normal or enriched environment will be examined. The validity of transparent cranial window will be proved if the results are the same as those from thinned-skull cranial window. This research is expected to break through the skull obstacle of transcranial cortical imaging in vivo, and to provide a safe, valid and convenient method for real-time monitoring the neurocircuitry plasticity in vivo. It is very significant to investigate the mechanism of feeling and memory, explore the pathogenesis of some neurological diseases, and develop treatments.

双光子激发荧光显微光学成像与转基因荧光标记技术相结合，为穿颅活体皮层神经环路可塑性研究提供了重要手段，但混浊的颅骨限制光的穿透深度，现有颅窗并不稳定。本项目提出建立“可开—关”的稳定颅窗，研究其在穿颅活体皮层神经光学成像的有效性、安全性与可靠性。具体如下：发展高效的颅骨光透明方法，建立基于光透明颅窗的皮层神经亚细胞结构树突棘成像方法；跟踪观测光透明颅窗对皮层小胶质细胞、星形胶质细胞的激活及皮层微血管结构与功能的影响，探讨其在活体应用的安全性；监测正常环境及丰富环境中皮层神经元亚细胞结构树突棘长消变化，并与磨薄颅窗穿颅活体成像结果比较，评价光透明颅窗实施穿颅活体皮层成像的可靠性。本项目的研究成果有望突破穿颅活体皮层光学成像研究中的颅骨障碍，为实时、在体、跟踪神经环路可塑性提供安全、可靠、简便易行的视窗。这对研究情感与记忆机理、揭示神经性疾病发病机制、发展有效治疗方法至关重要。

现代光学成像技术与转基因荧光标记技术的发展，为穿颅活体成像提供了重要手段，但皮层上方的混浊颅骨限制光的穿透深度，现有基于外科手术的颅窗并不稳定，严重影响了穿颅活体光学成像的发展与应用。组织光透明技术的发展为基于非手术的颅窗提供了新思路。本项目正是围绕可“开－关”的稳定颅窗而展开的，包括颅骨光透明方法的建立、在活体应用的安全性与有效性。.建立了一套定量评估颅骨光透明效果的方法，针对不同的成像需求发展了多种颅骨光透明方法，包括：适用于皮层血管、血流、血氧代谢成像的颅骨光透明方法，简化实施步骤、缩短了透明时间；考虑不同年龄阶段的颅骨组成、并结合显微物镜性质，分别发展了针对幼鼠与成年小鼠颅骨光透明方法以实施皮层双光子荧光成像。为了探讨颅骨光透明方法的安全性，我们主要从两个方面开展了研究：考察颅骨光透明是否会象其它基于手术的颅窗方法一样会引起炎症？对颅骨进行重复处理后，能否实施重复成像？皮层血管血流是否存在变化？结果表明，颅骨光透明方法既未对皮层造成明显的炎症反应，也没有出现皮层损伤，从而证明了光透明颅窗用于长期重复成像是安全的。在此次基础上，我们利用多种光学成像技术证明颅骨光透明方法在穿颅活体皮层成像的有效性。利用激光散斑成像、多光谱成像能获取高分辨的皮层血流、血氧信息；光声成像在脑血管成像的对比度及分辨率得以提升；针对成年与幼年小鼠实现了高分辨的皮层神经树突棘成像及动态观测。本项目的研究成果有望突破穿颅活体皮层光学成像研究中的颅骨障碍，为实时、在体、跟踪神经环路可塑性提供安全、可靠、简便易行的视窗。.在项目执行期间，发表论文8篇,参编1章英文书稿，获授权发明专利1项、由项目负责人指导的王静同学的博士论文获湖北省优秀博士学位论文。.