应用条件基因敲除小鼠研究TFPI-1对血管内皮细胞功能的影响

组织因子途径抑制物-1（TFPI-1）属丝氨酸蛋白酶抑制物家族成员，主要功能是抗凝血，也有一定的抗炎、抗平滑肌细胞增殖和诱导肾小球细胞凋亡等功能。TFPI-1基因敲除小鼠胚胎期即因卵黄囊或脑出血死亡，使得对它的生理功能研究缺乏有效的工具。鉴于TFPI-1在动脉粥样硬化、血栓性疾病、恶性肿瘤、严重感染和弥漫性血管内凝血中变化明显，因此有必要进一步明确TFPI-1在血管内皮细胞中的功能。目前我们已经成功制备了TFPI-1 LoxP小鼠，并获得了血管内皮细胞Tie2-Cre小鼠。本课题拟完成：1.制备血管内皮细胞TFPI-1基因条件敲除小鼠；2.应用病理学方法观察该小鼠血管内皮及血管的形态学变化；3.静脉注射不同剂量的脂多糖和乳腺癌细胞，观察小鼠炎症发生和肿瘤转移情况。通过上述研究，力图阐明TFPI-1在血管内皮细胞中的生理功能，明确它对炎症和恶性肿瘤转移的作用，为这两类疾病的防治提供理论依据。

为了确定TFPI-1对血管影响，我们先后制备了血管内皮细胞TFPI-1条件基因敲除小鼠和血管平滑肌细胞TFPI-1条件基因敲除小鼠。前者是将TFPI-1 flox小鼠和Tie2-Cre小鼠杂交，后者则是将TFPI-1 flox小鼠和Sma-Cre小鼠小鼠杂交。通过基因型鉴定,在子代小鼠中获得了血管平滑肌细胞TFPI-1基因条件敲除杂合子和纯合子小鼠。应用这两类不同类型的TFPI-1条件敲除小鼠，我们发现在血管内皮细胞TFPI-1基因条件敲除纯合子小鼠中：（1）扫描电镜和透射电镜结果显示，血管内皮细胞纯合敲除TFPI-1的小鼠肺组织中，80%微血管内皮细胞肿胀、损伤、细胞间连接不完整，而杂合与对照小鼠无明显异常；（2）用LPS和伊文思蓝（Evans blue）染液进行鼠尾注射，TFPI-1敲除小鼠与对照组有显著的差异，表明TFPI-1的敲除导致内皮细胞的屏障功能受损、渗透性增加；（3）通过构建黑色素瘤细胞（B16F10）和路易斯肺癌细胞（LLC）两种肿瘤转移模型，发现内皮细胞纯合敲除TFPI-1促进了肿瘤血道转移，与杂合敲除和对照组小鼠有极其显著的差异，说明TFPI-1具有血道抗肿瘤转移的作用；（4）qRT-PCR结果显示，肺和脾脏这两个器官组织中粘附分子、金属基质蛋白酶（MMPs）、细胞连接蛋白以及外基质蛋白mRNA表达水平和对照组相比均升高。而且MMPs、外基质蛋白在脾脏中表达上调更为显著，尤其是MMP-1上调了6倍。(5)在血管平滑肌TFPI-1基因条件敲除纯合子小鼠中，我们发现动脉粥样硬化斑块的大小、范围及严重程度等方面较对照组有显著增加，机制可能是TFPI-1 下调可促进胸主动脉平滑肌细胞发生凋亡，促凋亡基因如P53、Caspase-3和C-myc等基因的表达上调。应用免疫共沉淀加质谱分析，发现了多种可能与TFPI-1相互作用的蛋白；经过进一步的验证，发现AMOT与TFPI-1之间存在相互作用。