基于ITS2互补碱基变化分析的中药基原物种鉴定研究

Compensatory base changes (CBCs) in the ribosomal RNA (rRNA) internal transcribed spacer 2 (ITS2) secondary structures have been used to successfully verify the taxonomy of closely related species. However, CBCs have never been used to distinguish original species in Chinese medicine. In this study, we used sequence-tagged pyrosequencing and genome-wide analyses to characterize intra-genomic variations of internal transcribed spacer 2 (ITS2) regions from a wide range of medicinal plant species, especially including two genera Aconitum and Selaginella with many closely related species. The secondary structures of ITS2 from original species in Chinese medicine will be predicted and their CBCs will be analylized accordingly. Our researches should provide effective and direct evidence for the intra-genomic divergence of ITS2, and illustrate how CBCs of ITS2 variants can yield insights into species identification. In addition, the analytical protocol we shall establish may enable the construction of an ITS2-based database, a valuable resource for molecular identification of Chinese medicine and conservation of their genes. One CBC in an ITS2 sequence-structure alignment may be a sufficient condition to distinguish even closely related species. In summary, intra-genomic ITS2 variants represent a valuable source that help reveal the evolutionary histories of related species in Chinese medicine, and the major variants of ITS2 can be useful in phylogenetic and barcoding applications.

分子标记ITS2序列二级结构的 "互补碱基变化（CBCs）"已成功用于生物物种的鉴定，而ITS2的 CBCs规律在中药基原物种鉴定中的特性未被解析。本项目利用课题组已经获得根、茎、叶、花、果等不同部位入药的中药基原物种43万条ITS2序列，借助ITS2序列数据库二级结构预测工具进行空间结构构建，分析同一物种内、不同物种间的CBCs分布规律，揭示CBCs存在可能是中药基原物种鉴定的关键因素。进一步以乌头属和卷柏属中药基原物种为研究对象，利用高通量测序技术和ITS2序列空间结构分析，阐明同一物种内、不同物种间的CBCs分布规律，验证在大量近缘物种存在时CBCs对中药基原物种鉴定的影响。本项目将为中药DNA条形码鉴定和中药基原物种形成的研究奠定重要理论基础，有助于推动中药分子鉴定的实践应用，促进中药鉴定学走在国际生物分类和鉴定研究的前沿。

已有研究表明DNA分子标记ITS2序列二级结构中最重要的特征“互补碱基变化（Compensatory Base Changes, CBCs）”是物种鉴定的关键因素，而ITS2序列的 CBCs规律在中药基原物种鉴定中的特性未被解析。本项目利用课题组已获得中药基原物种的43万条ITS2序列，借助ITS2序列数据库二级结构预测工具进行空间结构构建，分析同一物种内、不同物种间的CBCs分布规律，结果表明中药基原物种基因组内存在CBCs的概率为万分之一，即不存在CBCs的概率是99.99%。物种间则明显存在CBCs，揭示CBCs对中药基原物种鉴定具有重要影响。进一步以乌头属和卷柏属药用植物为研究对象，利用高通量测序技术和ITS2序列空间结构分析，证实ITS2二级结构在乌头属和卷柏属不同物种间差异明显，验证在大量近缘物种存在时CBCs对中药基原物种鉴定的影响。在此基础上，以《中国药典》和《日本药局方》收载中药材及其混伪品为对象，包括一系列重要药用植物，如人参属人参、西洋参、三七、竹节参，石斛属铁皮石斛、金钗石斛等，柑桔属酸橙、橘等，麻黄属木贼麻黄、草麻黄，忍冬属金银花、山银花等，以药用植物通用条形码ITS2为主，psbA-trnH为辅，成功构建中草药DNA条形码鉴定数据库。本项目为中药DNA条形码鉴定和中药基原物种形成的研究奠定重要理论基础，有助于推动中药分子鉴定的实践应用。. 发表论文15篇，其中SCI收录论文5篇，5年影响因子大于10的论文1篇。获授权国家发明专利2项，本项目研究成果作为重要支撑之一，获得国家科技进步二等奖1项，教育部科技进步一等奖1项，中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已纳入《中华人民共和国药典》2015年版，为吉林林村中药开发有限公司、黑龙江江世药业股份有限公司等原料的物种鉴定提供技术支撑。2017年3月，建立中草药“基因身份证”入选“中国十大医学进展”。 2017年11月，项目负责人获得“国家卫生计生突出贡献中青年专家”称号。