一种全新的基于微环境调控构建高效脂肪酶固定化方法的研究

脂肪酶是一种重要的有机合成酶，在工业催化应用中常通过固定化技术来提高酶稳定性和降低成本。本项目拟研究一种新的基于微环境调控的固定化脂肪酶构建方法。首先，结合分子动力学模拟和微环境构像分析，表征酶蛋白与周围环境的相互作用关系，确定影响脂肪酶活性和稳定性的主要因素及其机理，为载体表面性质的人工设计和微环境调控提供理论指导，避免大量的试验工作。其次，以纤维织物膜材料为载体研究基于微环境调控的脂肪酶固定化方法，采用介体涂层和固定化后处理技术改变固定化酶的微环境，综合运用衰减全反射傅立叶变换红外、核磁共振等方法表征固定化酶的构象变化规律。在上述工作的基础上，针对酯化反应体系的应用特性，重点研究固定化酶微环境如亲疏水平衡对酶的活性和反应体系的水分配效应的影响，获得可以调控脂肪酶活性和稳定性的原理和方法，为通过界面工程理性设计高效的固定化酶提供理论和实践经验。

本课题围绕固定化脂肪酶的微环境调控展开工作。.首先通过分子模拟解析脂肪酶分子与溶剂和底物微环境的相互作用及活性、选择性变化规律。重点研究了脂肪酶Lip2在甲醇等强极性有机溶剂中活性口袋闭合的机制，发现脂肪酶Lip2存在两个具有协同作用盖子结构，通过比较限制动力学模拟进一步表明Lip2在极性溶剂环境下存在两条相互作用传播通路，从而解释了极性溶剂分子与第二个盖子Lid II之间的相互作用方式。微环境中少量的极性溶剂如乙腈分子的存在，会在活性口袋周围形成一个极性较强的区域，吸引水分子的聚集形成“水通道”。这些聚集的水分子会在一定程度上抑制酯化反应，从而导致脂肪酶在一些拆分反应中的选择性变化。实验过程也证明，在脂肪酶催化酯化拆分手性1-苯乙醇反应中，加入微量的乙腈后，酶的选择性E值由7提高到200以上。以上的研究揭示了酶与环境小分子的作用机制，为催化剂的理性设计和改造提供理论依据。.其次，针对纤维、磁性微球、弹性体聚氨酯和大孔树脂微球等类型不同、结构与表面官能团不同的载体类型，分别研究了基于疏水界面活化、基于离子键相互作用的PEI聚合物修饰、基于生物相容性作用的蛋白配基修饰和混合配基修饰的固定化酶微环境调控方法，并在酯化反应中对固定化酶的性能进行了验证评价。实验结果揭示了酶的活性、稳定性和选择性与固定化载体微结构以及表面微环境如基团种类、电荷密度、亲疏水平衡以及生物相容性息息相关。针对不同类型和特点的载体通过微环境调控的策略，酶活得到不同程度的提高，最高可以提高7倍，在酯化反应体系的中批次稳定性也得到相应的改善，平均达到30批以上。以上的研究为通过界面工程理性设计高效的固定化酶提供理论基础和实践经验。.本课题已发表SCI论文9篇，申请国家发明专利3项,培养了5名硕士。