水稻植酸代谢相关基因OsMRP5和Os02g0819400的分子生物学与功能研究

在前一国家基金及省科技项目的资助下，克隆了四个与植酸代谢相关的水稻突变基因，包括一个与拟南芥多药抗性相关基因AtMRP5同源的OsMRP5和一个在植物中未知具体功能的基因Os02g0819400（有多种剪切方式）。本项目将对这两个基因的分子生物学特性及其在水稻植酸代谢、耐生物和非生物胁迫中的功能与机制进行全面研究，包括：（一）基因的时空表达和亚细胞定位；（二）Os02g0891400转录子的剪切方式的组织、时空特异性；（三）OsMRP5在生物和非生物胁迫相应中的功能与作用机制；（四）过表达与组织特异性沉默转基因材料的培育及其表型分析，包括植酸含量，种子发育与活力，生物与非生物胁迫反应等。研究结果将大大推进对这二个基因的分子生物学特性和功能的认识，从而为水稻及其它作物植酸和抗逆性分子设计育种奠定理论和技术基础。

在前一个国家基金项目的资助下，运用生物信息学和基因定位技术确定了水稻基因OsMRP5（LOC_Os03G04920,与拟南芥多药抗性相关基因AtMRP5同源）和Os2-PGK（LOC_Os02G57400,存在有多种剪切方式，包含一个细菌与2-磷酸甘油激酶-2-PGK同源的功能域）与植酸代谢相关，三个低植酸（LPA）突变体的OsMRP5和Os2-PGK基因发生了错义突变或无义突变。但是，对这2个基因的分子生物学特征、其在植物生长发育及植酸代谢中的功能的研究基本处于空白。在本项目中，采用融合基因技术、突变体杂交后代比较分析、种子特异性基因沉默技术和基因同源和异源互补表达等技术，研究了这2个基因的时空表达、蛋白亚细胞定位、基因功能。主要研究结果如下：（1）基因的时空表达和亚细胞定位： OsMRP5在水稻的根、茎、叶、花药和发育的种子中都有表达，表达部位以维管束组织为主；Os2-PGK在根、叶、种子中均有表达，其蛋白主要定位在叶绿体中；在植物的组织不同部位均检测到该基因三种剪切方式的转录本，其中Os-2-PGK1.1在水稻成熟茎和种子中丰度最高，而Os-2-PGK1.2在叶片中表达最强，Os2-PGK1.3在所有组织中丰度都最低。（2）OsMRP5蛋白功能：将OsMRP5互补到拟南芥低植酸突变体atmrp后，筛选得到1个与野生型表型接近的株系，表明OsMRP5很有可能与AtMRP5功能相同；但在酵母中异源表达OsMRP5未成功；（3）基因突变对农艺性状的影响： KNBT-lpa和XQZ-lpa是2个2-PGK等位突变体，XS-lpa则是1个OsMRP5突变体，开发了3个功能性分子标记，育成并比较分析了3个突变体的F6代纯合LPA突变与野生型姐妹系的农艺性状及田间成苗率，发现其存在负面影响的同时，但也有一些纯合LPA株系的农艺性状和种子活力与原突变体相比的千粒重增加、种子活力上升；（4）OsMRP5和2-PGK种子特异性沉默：采用水稻油酸18基因的启动子和人工微小RNA/发夹RNA干扰技术，获得一系列OsMRP5和2-PGK种子特异性沉默的转基因水稻，其无机磷含量显著上升，植酸含量显著下降。与野生型姐妹系相比，OsMRP5沉默系总磷含量普遍降低，株高、有效穗数无显著差异，但百粒重显著下降（14%-22%），而2-PGK沉默系的上述指标均无显著差异。此外，还分析了LPA种子的