基于外显子组测序的乳腺癌肝转移钙离子通道相关基因的鉴定及机制研究

Liver metastases from breast cancer still remains an important poor prognostic factor and clinical treatment trouble for breast cancer and the underlying molecular mechanism has yet to be elucidated. Using the high-throughput sequencing platforms we recently performed the exome-sequencing for the paired primary and metastatic liver cancer tissues of breast cancer, screening for the mutation profiles for liver metastases from breast cancer. Bioinformatics analysis showed the mutations for breast cancer with liver metastases are enriched in calcium signaling pathway genes. This study will focus two calcium channel genes of RYR3 and CACNA1A to systematically evaluate the genetic variations in these two genes among an extended sample set with 20-paired primary breast cancer and metastatic liver cancer tissues by target region sequencing technique. The candidate higher-frequency mutations will be identified in another 200 breast cancer patients with liver metastases, followed by the functional study to explore the mechanism of the mutation site in liver-metastatic breast cancer. The findings will provide some new diagnostic and prognostic markers of these patients as well as the possible new therapeutic targets for clinical treatment.

乳腺癌肝转移是乳腺癌重要的预后不良因素和临床治疗的难点，其分子机制目前仍未被阐明。课题组前期利用新一代高通量测序平台对乳腺癌患者配对原发癌和肝转移癌标本进行外显子组测序，初步筛选出与乳腺癌肝转移相关的候选突变位点，通过生物信息学分析发现这些变异位点富集于钙信号通路基因上。本项目拟采用目标区域深度测序技术对20例乳腺癌伴肝转移患者的配对原发癌和肝转移癌组织进行钙离子通道相关基因RYR3和CACNA1A的进一步筛选，以期系统探讨RYR3和CACNA1A基因遗传变异与乳腺癌肝转移的关系，筛选出较高频的突变位点，并用200例同样的病人进行大样本鉴定，进而对所确定的突变位点在乳腺癌肝转移中的作用机制进行相关的功能性研究，从而为临床提供新的诊断和预后判断指标，也为相关药物研发提供可能的新型治疗靶点。

乳腺癌肝转移是乳腺癌重要的预后不良因素和临床治疗的难点，其分子机制目前仍未被阐明。课题组在前期研究的基础上，首先在20例乳腺癌肝转移患者中进行RYR3和CACNA1A的编码区和调控区进行目标区域深度测序，发现RYR3和CACNA1A的突变率为10%，生物信息学分析三个突变位点均为非同义突变并具有潜在的功能，其中RYR3的两个突变位点位于基因功能域中。采用免疫组化的方法检测RYR3表达水平，发现RYR3基因突变并不影响其表达水平；同时在乳腺癌癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）中对RYR3的S923L位点进行体外功能学研究，构建表达载体并转染细胞，观察细胞生物学行为的改变以及相关信号通路关键基因的蛋白表达水平。结果发现，突变位点对细胞生长、侵袭和迁移无影响，但能显著降低E-CAD和升高MMP2蛋白表达水平（P<0.05）。提示突变位点通过改变RYR3下游信号通路蛋白表达水平发挥作用。由于RYR3和CACNA1A基因突变率较低，进一步在254例乳腺癌人群中扩大验证，对基因的编码区和调控区进行深度测序。RYR3和CACNA1A的突变率均为3.7%；生存分析发现，RYR3突变型患者预后较差（RR=4.412，P=0.017），此效应在Luminal亚型患者中更显著；同时，RYR3突变型患者较易发生转移（RR=4.255，P=0.073）。未发现CACNA1A突变对乳腺癌生存期和转移的影响。本项目研究结果提示：RYR3基因体细胞突变与乳腺癌患者，尤其是Luminal亚型患者的总生存和肝转移密切相关；功能学研究发现RYR3 S923L位点突变型对乳腺癌细胞系中E-CAD和MMP-2蛋白的表达水平有显著影响。因TCGA乳腺癌患者随访时间较短，本研究结论未得到验证；未来将进行更大样本的验证研究。上述研究结果为乳腺癌肝转移的临床提供新的诊断和预后判断指标，也为相关药物研发提供可能的新型治疗靶点。