耐寒邓恩桉低温响应的EdWRKY转录因子抗寒分子机理研究

LEucalyptus was the fast-growing and high-yielding iconic species commercial forest in South China. Low temperature and cold damage is the main stress factor for the eucalyptus plant cultivation. Eucahetus dunnii is the cold hardy and good wood material eucalyptus varieties. Ascertaining its resistance mechanism of resistance to low temperature stress and analyzing the mechanism of action on the key gene has theoretical and practical significance to cultivate cold-resistant varieties of eucalyptus. This project using hardy E. dunnii as the research object and the transcriptome data information of E. dunnii under the condition of low temperature as the breakthrough point. Through screening the low temperature active response EdWRKY, further determining the differentially expressed genes of EdWRKY and identifying its transcriptional activity. Using the Tail-PCR and the GUS quantitative analysis, study the cold EdWRKY gene promoter activity, in combination with the the expression mode in different stress conditions under Real-time PCR, jointly discussing the function of the EdWRKY gene promoter. The genetic transformation of the EdWRKY gene combination of different types of promoter for the not hardy varieties of eucalyptus, carrying out the molecular identification of transgenic plants. Further screening of cold resistance strong positive strain, and identifying the cold resistance and performing transcriptome analysis, analyzing the function of the EdWRKY gene. This study aims to reveal molecular regulatory mechanism on cold resistance of EdWRKY in eucalyptus, meanwhile can providing material and laying the theoretical foundation for the cold resistance breeding of eucalyptus.

桉树是我国南方速生丰产用材林标志性树种，但低温冷害是限制其栽培种植的重要逆境因子。邓恩桉耐寒和材质优，探明其耐低温胁迫的抗性机理和解析关键基因作用机制，对培育耐寒桉树品种具有理论和实践意义。本研究以耐寒邓恩桉为研究对象，以低温胁迫条件下其表达谱数据分析为切入点，通过筛选低温响应积极的WRKY转录因子，确定差异表达的EdWRKY基因和鉴定其转录活性；采用Tail-PCR和GUS定量分析等手段研究其启动子活性，结合荧光定量PCR研究其在不同逆境条件下表达结果，探讨该启动子功能；通过构建EdWRKY基因结合不同类型启动子表达载体，遗传转化尾巨桉，开展转基因植株分子鉴定工作；进一步筛选耐寒性强的阳性株系，进行抗寒鉴定和表达谱分析等工作，分析EdWRKY基因的功能。本研究旨在揭示EdWRKY在桉树抗寒方面所起的分子调控作用，为利用邓恩桉耐寒基因进行桉树抗寒分子育种研究提供材料和奠定理论基础。

桉树是我国南方速生丰产用材林标志性树种，但低温冷害是限制其栽培种植的重要逆境因子。邓恩桉耐寒和材质优，探明其耐低温胁迫的抗性机理和解析关键基因作用机制，对培育耐寒桉树品种具有理论和实践意义。WRKY 作为植物所特有的一类转录因子在植物抗逆境反应中发挥重要作用，但目前的研究主要集中在拟南芥、烟草、水稻等模式植物，对 WRKY 在桉树低温逆境条件下的作用及其机制的研究尚未见报道。本研究以耐寒邓恩桉中低温响应积极的WRKY转录因子研究对象，确定差异表达的EdWRKY基因和鉴定其转录活性；采用Tail-PCR和GUS定量分析等手段研究其启动子活性，结合荧光定量PCR研究其在不同逆境条件下表达结果，探讨该启动子功能；通过构建EdWRKY基因的过量载体，遗传转化烟草和尾巨桉，开展转基因植株分子鉴定工作，分析EdWRKY基因的功能。结果表明：(1) 转录组数据共鉴定出586个差异表达的转录因子包括AP2, NAC，MYB，WRKY等65类转录因子，其中有9个差异表达的WRKY类转录因子；(2) 克隆得到了一个特异表达的EdWRKY1基因全长，通过生物信息学分析其相关特性和分析了其转录因子的特性；(3) EdWRKY1 基因的启动子克隆及功能分析；(4) EdWRKY1在高温和干旱条件下表达均比对照增强，且在低温处理条件下在不耐寒品种尾巨桉不表达；(5)获得了超表达EdWRKY1基因的烟草植株，转基因烟草植株的抗寒性明显增强；(6) 优化不耐寒桉树品种尾巨桉树的遗传转化体系，获得转化EdWRKY1 基因的尾巨桉抗性苗。本研究结果能初步揭示EdWRKY在桉树抗寒方面所起的分子调控作用，为利用邓恩桉耐寒基因进行桉树抗寒分子育种研究提供材料和奠定理论基础。