microRNA对NFATc1/RANKL骨免疫信号通路的调控机制研究

Activated T lymphocytes can secrete RANKL, which stimulates osteoclastogenesis. MicroRNAs regulate several cell process, including osteoclastogenesis. The present study is aimed to investigate microRNAs involved in regulation of RANKL and NFATc1 expression, and the role of NFATc1 in regulation of RANKL expression in activate T cells. First, bioinformatics analysis is applied to predict possible microRNAs which may bind to NFATc1 and RANKL transcripts. Then microRNA microarray assay can produce microRNA profiling of activated T cells. Both results are comparatively analyzed and coincident microRNAs are generated as candidate microRNAs for further investigation. The binding efficiency of candidate microRNAs with target gene transcripts, such as NFATc1 and RANKL, is tested by luciferase reporter gene assay.Pri-miRNA lentivirus constructs of candidate microRNA is built and used to transfect target cells, in order to determine the effects of microRNA. Chromatin immunoprecipitation, together with gain and loss of gene function analysis, is used to study the regulatory role of NFATc1 on RANKL expression.The research can reveal the microRNAs involved in regulation of NFATc1 expression in activated T cells, as well as RANKL in osteoclasts. The results can be applied to clarify the molecular mechanisms of inflammatory bone resorption, which may provide possible new therapeutic target of periodontitis.

活化T淋巴细胞分泌RANKL促进破骨细胞分化；miRNA参与调控破骨细胞分化。本课题旨在研究以RANKL和NFATc1为靶向的miRNA，以及活化T淋巴细胞中NFATc1对RANKL表达的调控作用。首先通过生物信息学分析预测可能与NFATc1/RANKL结合的miRNA，选取与miRNA微阵列分析结果一致的作为候选miRNA进行研究；采用萤光素酶报告基因技术，构建含有Luciferase报告基因和 NFATc1或RANKL 3'UTR序列的载体，验证候选miRNA是否与目的基因有效结合；构建pri-miRNA慢病毒载体转染细胞，检测miRNA的调控作用及下游效应。采用染色质免疫共沉淀技术和基因功能学实验，分析活化T淋巴细胞中NFATc1对RANKL表达的调控作用。本研究将揭示miRNA对NFATc1/RANKL信号通路的调控作用，阐明炎症性骨吸收的分子机制，为牙周炎的靶向治疗提供新的思路。

研究背景.microRNA可通过靶向结合到 mRNA引起蛋白翻译抑制或目的mRNA 的降解，从而调控基因表达。破骨细胞是唯一具有骨吸收功能的细胞，其分化与功能受多种炎症因子及转录因子的调控，其中活化T细胞核因子-1（NFATc1）在破骨细胞分化过程中发挥核心调控作用。本研究拟探讨 microRNA调控 NFATc1/RANKL 表达的机制，以及 NFATc1/RANKL 信号通路在炎症性骨吸收中的作用。.研究内容.1..microRNA 对 T 淋巴细胞 RANKL 表达的调控机制研究 .2..microRNA 对巨噬细胞向破骨细胞分化过程中 NFATc1 表达的调控 .研究结果.1..生物信息学分析预测可能与RANKL基因tnfsf11表达相关的microRNA，获得结果为mmu-miR-144-3p；采用免疫磁珠分选法得到纯化的小鼠CD4+T淋巴细胞，建立炎症刺激模型，发现CD4+T淋巴细胞的RANKL表达量下降，同时mmu-miR-144-3p的表达增加。RANKL与mmu-miR-144-3p表达变化的负相关关系提示mmu-miR-144-3p可能对RANKL表达具有抑制作用。.2..生物信息学分析预测可能与 NFATc1结合的 microRNA，选择mmu-143-3p作为验证目标。采用RAW264.7细胞建立破骨细胞分化模型，real-time PCR结果发现在不同时间点nfatc1和mmu-miR-143-3p基因表达均表现出相关趋势，利用双荧光（Rluc/Fluc）素酶报告基因技术验证，发现mmu-miR-143-3p不能与 nfatc1-3’UTR 预测的靶位点结合，可能存在其他潜在结合位点。.科学意义. microRNA 在破骨细胞分化的多个环节发挥调控作用，本研究发现了两种可能参与破骨细胞分化过程基因调控的microRNA。由于免疫反应和骨代谢反应共同具有非常复杂的网络调控机制，我们初步发现的microRNA与基因调控的相关性可能为进一步揭示其具体的作用机制奠定了基础。在未来的研究中我们将一方面继续验证mmu-miR-143-3p和mmu-miR-144-3p在骨免疫RANKL/RANK/OPG调节轴中的作用机制，另一方面进一步筛选和验证可能参与调控淋巴细胞RANKL表达和破骨细胞NFATc1表达的microRNAs。