DNA氧化损伤修复基因microRNA结合位点的序列变异及其功能改变与年龄相关性白内障的关系

The pathogenesis of age-related cataract (ARC) remains unclear. Our previous study found that sequence variation of DNA oxidative damage repair gene in the promoter and coding region were associated with ARC, but not yet its pathogenesis. We assume that microRNA binding sequence variation of DNA oxidative damage repair gene 3′UTR region, which can regulate the expression of mRNA and protein directly, is the leading cause of ARC in molecular mechanisms. In this study, we will use samples from a population-based cohort and a hospital-based case-control to test the association of genotypes in microRNA bingding region of DNA oxidative damage repair genes with ARC. The surgery biopsy of lens anterior capsule will be used to measure the gene expression of the targeted genes and DNA lesion, and their relationship with the genotypes. Lens epithelium cell line by transfecting different SNP plasmids will further confirm the role of the genotypes in the gene regulation. Finally, we will establish primary culture lens epithelium cells, test their genotypes, transfect various microRNA mimics/inhibits/controls plasmid to detect the gene expression and DNA lesion. The functional regulation and intervention studies of the above genes may further elucidate the genetic pathogenesis of ARC. Most importantly, it will offer the proof of concept for microRNA intervention for ARC personalized prevention of different genotypes and therapy targeting ARC prevention.

年龄相关性白内障（ARC）发病机制仍不清楚。我们之前的研究发现DNA氧化损伤修复基因启动子和编码区序列变异与ARC有关,但尚未探讨其致病机理。本课题假设可直接调节mRNA及蛋白质表达的氧化损伤修复基因3′UTR区microRNA结合位点的序列变异是导致ARC的分子机制。拟以人群样本和医院病例为对象（独立双样本），检测氧化损伤修复基因microRNA结合位点的序列改变及基因分型，分析其与ARC发病的关系；收集晶状体前囊膜上皮细胞分析相应基因的表达、细胞损伤与基因型和ARC的关系；转染不同基因型质粒到晶状体上皮细胞株证实基因型与基因表达的关系；转染microRNA的模拟物、阻遏物和对照质粒到晶状体上皮原代培养细胞，测试其对相应基因的调节及细胞损伤的影响。以上基因的功能调控和干预研究可进一步阐明ARC的发病机制，为设计以microRNA 为靶点的不同基因型ARC的个性化防治奠定基础。

年龄相关性白内障（ARC）是国内外最常见的致盲性眼病，其病因及发病机制尚不明确。本项目采用病例对照研究，从“江苏眼病研究”流行病学人群收集ARC患者804名（皮质型284例，核型349例，后囊下型33例及混合型138例），同时收集与之匹配的对照者804名。选取位于DNA双链断裂修复（DSBR）和核苷酸切除修复（NER）等通路中的30个基因3'UTR的38个SNP位点。采集受试者外周静脉血，提取其全血基因组DNA，使用实时荧光这些SNP位点的基因型，并进行显性及隐性遗传模型分析。在“江苏眼病研究”流行病学人群和医院病例对照中随机选取样本，收集其外周血及晶状体上皮细胞（LECs）。运用彗星实验检测外周血淋巴细胞及LECs的DNA的氧化损伤程度，方差分析不同基因型之间彗星测定参数的差异。然后分别构建位点不同等位基因的报告基因载体，与生物信息学预测的相应微小核糖核酸（miRNA）的mimics/controls分别共转染到细胞株中，检测荧光素酶报告基因的表达，比较SNP位点不同基因型对“miRNA-靶基因”作用的影响，证实SNP位点的生物学功能。最后选择基因分型为功能等位基因纯合子的细胞株，转染miRNA mimics /inhibitors到细胞中，检测氧化损伤基因的表达，验证SNP位点的功能。结果发现：在被检测的38个SNPs位点中，ATM-rs4585 、ZNF350-rs2278414 、XRCC5-rs1051685、SMUG1-rs971与 ARC的发生易感性相关（P=0.002，OR=1.24；P=0.0005，OR=1.36 ；P<0.001，OR=1.61；P=0.002，OR=1.26），XPC-rs2229090的G等位基因与核性ARC（ARNC）的易感性负相关（P < 0.001; OR = 0.60），RAD52- rs1051669与核性ARC相关（P=0.002，OR=0.71）。彗星实验发现ARNC患者外周血淋巴细胞和LECs的DNA的断裂程度比正常对照要高（P < 0.001），但未见该差异与SNP位点不同基因型有关(P > 0.05)。这些SNP位点可能通过调节microRNA的亲和力，异常下调氧化损伤基因导致DNA双链断裂修复缺陷，影响ARC的发生发展。已发表SCI论文11篇，总影响因子35.86，中文文章13篇，参加国内外会议18次