小G蛋白ROP2动态定位的分子调控机理研究

The small GTPases, Rho of plants (ROPs), are molecular switches regulating cell morphogenesis, inter- and intracellular signaling, as well as environmental responses in plants. ROPs are dynamically targeted to the plasma membrane (PM) and control key intracellular activities such as dynamic organization of cytoskeleton, calcium signaling, and the production of reactive oxygen species by mediating the subcellular localization and activities of effectors. The activity of ROPs is regulated by guanine nucleotide exchange factors (RopGEFs) and GTPase activating proteins (RopGAPs) whereas guanine nucleotide dissociation inhibitors (RhoGDIs) maintain the stability of ROPs in the cytoplasm and extract ROPs from the PM. Despite of extensive studies in the past 20 years, the molecular mechanisms underlying the dynamic targeting of ROPs to the PM are obscure. Previous studies by the applicant have shown that RhoGDIs play positive roles in the PM targeting of ROPs. In addition, vesicle trafficking is another route, likely parallel to the GDI pathway, through which ROPs are delivered to the PM. The coordination of GDI and vesicle trafficking pathways is potentially crucial for the dynamic PM association of ROPs during polarized growth of plant cells. This proposal aims to 1) examine routes and key regulators of the vesicle trafficking pathway that mediates the PM targeting of ROPs; 2) understand the molecular mechanisms underlying the coordination between GDI and vesicle trafficking pathways on the dynamic localization of ROPs during polarized cell growth. Results obtained will give novel insights into molecular mechanisms underlying plant cell morphogenesis.

小G蛋白ROP是植物细胞内一类重要的分子开关，调控细胞形态建成、信号传导、环境应答等活动。ROP在质膜上动态定位，影响多种效应蛋白的分布及活性，从而调控细胞骨架的动态组装、钙信号、活性氧产生等胞内活动。鸟苷酸交换因子RopGEF以及GTP酶激活因子RopGAP调控ROP的活性，而鸟苷酸解聚抑制因子GDI控制ROP在胞内的稳定性、并促进ROP从质膜进入胞质的过程。然而，ROP靶向质膜的调控机理目前尚不清楚。申请人的前期工作表明GDI介导ROP快速靶向质膜的过程，而ROP在质膜上的动态定位还依赖于囊泡运输途径。GDI及囊泡运输途径可能协同介导ROP在细胞极性生长过程中的动态定位。本项目拟利用细胞学、遗传学、药剂学等手段，阐明调控ROP动态定位的囊泡运输途径及关键因子，解析极性细胞生长过程中GDI与囊泡运输途径协同调控ROP动态定位的分子机理，为了解植物细胞形态建成机制提供重要信息。

ROPs是植物中一类重要的小G蛋白，在植物生长发育、激素信号转导、抗逆和抗病过程中起重要的调控作用。研究发现ROPs的极性定位对植物细胞的极性生长至关重要，目前在植物中ROPs的极性定位的调控机制研究尚不清晰。ROPs作为“分子开关”，分为GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式，调控其形式转变的作用因子分为三类， 鸟苷酸交换因子、GTP酶活化蛋白和鸟苷酸解离抑制因子。目前植物关于GDI调控ROP的机制研究并不是很清晰，在动物及酵母Rho靶向质膜的途径除了GDI参与外，还通过特定的囊泡运输途径介导。本研究旨在揭示拟南芥GDI及囊泡运输对重要的小G蛋白ROP2动态定位的调控作用。我们利用遗传学和药剂学的手段，阻断特定的囊泡运输途径，分析ROP的动态定位依赖于哪些囊泡运输途径。我们的结果表明ROP2的动态定位依赖于SAR1调控的内质网的外排途径、ARF1及布雷菲德菌素A敏感的的高尔基后囊泡运输途径。我们进一步的研究结果表明AP1介导的TGN/EE上的外排途径参与ROP2靶向质膜的过程。当ROP2脂链修饰被破坏的突变体plp-3中，ROP2的囊泡运输途径受到了影响，质膜定位的ROP2含量下降。同时通过荧光漂白恢复实验对野生型和scn1-1突变体根表皮细胞质膜上GFP-ROP的定位进行研究，在野生型中质膜上的GFP-ROP2被漂白后能够快速恢复，在scn1-1突变体中GFP-ROP2的恢复速度明显慢于野生型。说明GDI1对于ROP2靶向质膜的过程具有关键作用。为研究囊泡运输途径与GDI调控途径对ROP2极性定位的调控机制，同时破坏囊泡运输途径与GDI调控途径后，植株矮小，植物细胞极性生长受到影响且细胞变小，ROP2的动态定位受到影响。我们发现囊泡运输途径与GDI1途径协同调控ROP2的动态定位，进而影响植物细胞的极性生长及细胞大小。其中GDI途径在ROP2快速靶向质膜的过程中具有至关重要的作用。