基于miR-29a调控DKK1/Wnt信号通路探讨补肾强督方干预强直性脊柱炎新骨形成的机制研究

New bone formation is the major factor that impact on the prognosis of ankylosing spondylitis. Osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) is the main way in the process of new bone formation of AS. It has been demonstrated that miR-29a inhibit DKK1 and then activate Wnt signaling pathway during new bone formation. It has been proved that significantly higher expression of miR-29a and lower expression of DKK1 was observed in PBMCs of AS patients which showed the importance of miR-29a in new bone formation. Bushen Qiangdu Recipe（Qiangdu Recipe），a well-developed formula created by a famous doctor of Chinese medicine, has been proved up-regulating DKK1 level in treating AS. Based on the regulating effect of DKK1 and its benefits in anti-ossification, we proposed the hypothesis: the mechanism of Qiangdu Recipe in the treatment of AS new bone formation could be regulating miR-29a level and DKK1/Wnt signaling pathway resulted in intervention of osteogenic differentiation of BMSCs. In this research, ectopic ossification animal model of elder male DBA/1 mice and BMSCs would be used to detect the effect of Bushen Qiangdu Recipe on miR-29a、DKK1、Wnt signaling pathway. The research is of great importance helping us understanding the target of this Chinese medicine in treating new bone formation of AS, forming treatment methods for early stage to postpone the process of new bone formation.

新骨形成是强直性脊柱炎（AS）预后不良主要因素、治疗难点及研究热点。骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化是AS新骨形成主要方式，新的发现miR-29a通过抑制DKK1激活Wnt信号通路调控骨形成过程，已证实AS患者miR-29a水平上调、DKK1下调，推测miR-29a在AS新骨形成中发挥了关键作用。名老中医经验方补肾强督方（强督方）临床应用12年治疗AS获良效，前期发现本方可上调DKK1，延缓AS新骨形成。据此提出假说：强督方延缓AS新骨形成机制是通过调控miR-29a影响DKK1/Wnt信号通路干预BMSCs成骨分化来实现的。本研究拟动物及细胞实验结合，利用 DBA/1小鼠及BMSCs成骨过程，分析强督方对miR-29a、DKK1/Wnt信号通路的调控作用，并运用转染miR-29a技术进一步验证。本项目对于探索AS新骨形成机制及中药作用靶点，开发有效药物，改善疾病预后，具有重要意义。

强直性脊柱炎（AS）是一种好发于青年人的慢性炎性疾病，脊柱、骶髂关节的炎症及新骨形成是AS的特征性改变，新骨形成导致的结构损伤很难逆转，是影响疾病预后、造成患者致残的主要因素。现代医学虽然在控制 AS 炎症方面取得较为明显的进展，但尚无确凿证据显示这些药物能够控制 AS 新骨形成。全国名老中医阎小萍教授研制出经验处方补肾强督方，主治强直性脊柱炎（大偻）肾虚督寒证。前期我们对补肾强督方能进行了探索性研究，结果证实补肾强督方能够抑制 AS 附着点、滑膜关节、软骨结合处的新骨形成。此外我们发现本方能够上调 AS 患者血清 DKK1 水平，发现 AS 患者新骨形成与经典 Wnt 信号通路抑制因子DKK1 水平下调，该通路激活有关。为进一步深入探索补肾强督方上调 DKK1 的作用靶点及其抑制 AS新骨形成的具体分子机制，我们开展了本课题。本研究拟动物实验运用一种能自发形成关节炎和新骨形成的动物模型老龄雄性DBA/1 小鼠动物模型，以补肾强督方灌胃给药，采用组织学观察小鼠韧带及附着点部位的骨化程度，免疫组化法、Real-time PCR方法、Western-blot 方法检测相关通路指标；细胞实验利用BMSCs细胞株，按照成骨培养条件对细胞进行诱导分化，以预先制备的补肾强督方中药含药血清干预细胞，光学显微镜下观察细胞形态，免疫组化法、Real-time PCR方法、Western-blot 方法检测相关通路指标，从而分析补肾强督方对BMSCs成骨的影响。研究发现本方含药血清对BMSCs能促进BMSCs成骨分化中DKK1蛋白和mRNA表达，抑制B—catenin蛋白和mRNA表达，且呈剂量依赖性，提示补肾强督方能调节BMSCs细胞成骨分化中Wnt通路，具有抑制AS异位骨化的作用。我们还发现本方能够抑制自发性 AS 模型 D BA /1 小鼠成骨分化中 Wnt 通路的激活，上调 DKK- 1水平，下调 wnt5a 、wnt3a、miR29a,这些均提示该方可能通过 Wnt 通路抑制 AS 异位骨化。以上实验进一步深入探索补肾强督方抑制Wnt通路激活作用靶点以及干预 AS异位骨化形成的具体分子机制，针对目前AS新骨形成缺乏有效治疗药物的现状，为今后药物进一步研发起了很好的指导作用。