牵牛子树脂糖苷成分及其对水通道蛋白3调节效应的研究

Pharbitidis semen is famous for its outstanding cathartic effect, and also is reported to show the antitumor effect. However, its material basis and mechanism remain unclear because of its main ingredients resin glycosides have complex and similar structures. Aquaporins (AQPs) discovered in the past few years belong to membrane protein families, which take responsibility of water transport and are considered as a potent target for anticancer. In this project, resin glycosides in pharbitidis semen will be first isolated and elucidated using our established techniques including specific detection, fast separation and structure identification based on the spectroscopic and chemical methods. Then the effects and mechanisms of resin glycosides from Pharbitidis Semen on aquaporin-3 (AQP3) expression in rat colon and in HT-29 cells will be investigated with Western blot and PCR. The study will further investigate the resin glycosides inhibition of HT-29 cells proliferation via PI3K/AKT signal pathway dependent down regulation of aquaporin 3, which will explain the antitumor mechanism of the resin glycosides. This project will illuminate the material basis and mechanism of pharbitidis semen exhibiting cathartic and antitumor effect, and also promote the application of the resin glycosides for better understanding traditional Chinese medicines.

牵牛子为峻下利水中药，主要有泻水通便、消痰涤饮的功效, 临床上用于治疗水肿胀满、二便不通、痰饮积聚等病症。现代研究表明其主要药理作用是泻下和抗肿瘤。因主要成分树脂糖苷结构复杂、极性相近而难以分离，至今牵牛子的药效物质基础和作用机制仍不清楚。水通道蛋白是主要负责水分子转运的一类膜蛋白, 也作为抗癌治疗的一个潜在靶点。本项目拟在多年的研究基础上，应用已建立的针对树脂糖苷特异性检识、快速分离和结构测定的技术，从牵牛子中分离和鉴定树脂糖苷成分；继而使用Western blot、PCR等手段，考察树脂糖苷对大鼠结肠和结肠癌细胞HT-29的水通道蛋白3的表达影响，以及这种影响对PI3K/Akt通路的调控作用，来探讨牵牛子“泻水通便（泻下）、消痰涤饮（抗肿瘤）”的分子生物学本质。本项目将现代科学技术与中医药理论相结合，有利于阐明牵牛子的物质基础和作用机理，也对促进树脂糖苷的开发利用具有重要的意义。

牵牛子为峻下利水中药，主要有泻水通便、消痰涤饮的功效。现代研究表明其有泻下和抗肿瘤作用。但至今牵牛子的药效物质基础和作用机制仍不清楚。本项目在多年的研究基础上，通过氨基硅胶柱无水溶剂条件下(CH2Cl2-MeOH)催化甲酯化，随后通过色谱方法成功实现这类成分的分离，共得到12个树脂糖苷甲酯化合物。并综合运用波谱学和化学沟通方法，鉴定了这12个树脂糖苷类成分的结构，从而证实了树脂糖苷是牵牛子的主要成分，并且具备独特的开环结构。在此基础上，体内和体外实验证实了牵牛子树脂糖苷部位（RFP）具有显著的抗肿瘤和泻下的作用。RFP可以通副凋亡方式引发肿瘤细胞死亡。蛋白水平研究发现RFP可引起了内质网应激以及蛋白酶体功能抑制，并激活MAPK信号通路。进一步机理研究表明RFP含有游离的羧基，可改变细胞内的pH, 而细胞内Cl-含量可以调节细胞的pH，渗透压和体积。RFP能够激活氯离子通道CLIC1，增加细胞Cl-浓度。从而证明CLIC1是牵牛子树脂糖苷诱导副凋亡的关键早期信号。同时，通过蛋白质印记实验和免疫组织化学实验证明RFP能抑制水通道蛋白AQP3在大鼠结肠的表达，同时激活了NF-kB通路介导的PGE2生成。从而证实RFP通过影响PGE2的分泌以降低 AQP3蛋白的表达，从而调控水转运起到泻下作用，并且免疫共沉淀发现AQP3蛋白与CLIC1存在相互作用。最后，我们发现单体树脂糖苷化合物CE能够下调水通道蛋白表达，并抑制结肠癌细胞的迁移与侵袭。进一步的机制研究表明， CE通过下调水通道蛋白抑制结肠癌细胞EMT的过程依赖于Smad2/3的参与。在体内实验性肺转移模型中，CE同样能够抑制结肠癌细胞的肺转移。因此，本研究不仅证实了树脂糖苷是牵牛子抗肿瘤和泻下作用物质基础，而且阐明了树脂糖苷抗肿瘤和泻下作用的分子机制都与其作用水通道蛋白相关，为牵牛子“泻水通便（泻下）、消痰涤饮（抗肿瘤）”功效提供了科学依据。