氧化还原信号调控拟南芥花粉管与柱头互作的分子机理研究

The interaction between pollen and stigma is essential for plant pollination. The molecular mechanisms uderlying pollination recognition remains to be investigated, although several factors implicated in pollen-stigma interaction have been identified. In our previous work, we identified a double mutant of NADPH-dependent thioredoxin reductase A (NTRA) and glutathione reductase 1 (GR1) of Arabidopsis, annotated as gr1 ntra. We found that the gr1 ntra double mutant block the transmission of male gametophyte. Further analysis revealed that defect in GR1 and NTRA influenced pollen tube growth on stigma surface, and the mitochondria of gr1 ntra were abnormal. We have identified 6 TRX proteins that interact with NTRA by using yeast two-hybrid. In this project, we intend to further analyze the phenotype of gr1 ntra, and investigate the mechanism of GR1 NTRA involved in the pollen tube-stigma interaction. GR1 and NTRA are important components implicated in redox signaling in plant cell. We expect that the results of this project can provide new information on the redox signaling regulating the interaction between pollen tube and stigma during plant pollination.

花粉管与柱头的互作是植物授粉识别过程的重要步骤，涉及到复杂的调控。虽然已经鉴定出几个调节花粉与柱头互作的因子，但对深入理解花粉和柱头互作的分子机制还是不够的。我们在前期工作中鉴定到一个拟南芥NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶NTRA和谷氧还蛋白还原酶GR1的双突变体gr1 ntra，该突变体雄配子体不能传递到后代。进一步分析发现GR1和NTRA双突变的花粉能在柱头表面萌发，但是花粉管在柱头表面停止生长，不能生长进入柱头和花柱。gr1 ntra双突变体花粉的线粒体异常。我们通过酵母双杂交已鉴定出6个与NTRA互作的硫氧还蛋白（TRX）。GR1和NTRA在植物细胞的氧化还原信号中起作用。本项目拟在前期工作的基础上，进一步分析gr1 ntra表型，并深入研究GR1和NTRA参与花粉管与柱头识别的作用机制，为理解氧化还原信号调控植物授粉过程中花粉管与柱头互作的分子机理提供信息。

花粉管与柱头的互作是植物授粉识别过程的重要步骤，涉及到复杂的调控。虽然已经鉴定出几个调节花粉与柱头互作的因子，但对深入理解花粉和柱头互作的分子机制还是不够的。我们在前期工作中鉴定到一个拟南芥NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶NTRA和谷氧还蛋白还原酶GR1的双突变体gr1 ntra，该突变体雄配子体不能传递到后代。本项目在前期工作的基础上，主要研究了gr1 ntra表型分析与突变体遗传互补；gr1 ntra花粉氧化还原状态变化及ROS水平分析；鉴定与NTRA互作的蛋白，找出被NTRA还原的硫氧还蛋白；鉴定TRX与GRX功能。通过从拟南芥突变体库购买gr1和ntra的相关突变体进行杂交和回交实验进一步确认了gr1 ntra双突变导致雄配子功能丧失；分别通过标记活性氧的荧光染料CM-H2DCFDA和转Grx1-roGFP2iL的拟南芥株系与gr1/+ ntra/-进行了杂交对野生型和突变体花粉染色发现gr1 ntra 双突变体中活性氧水平显著升高；通过在gr1/+ ntra/- 和gr1/- ntra/+ 中表达了带有花粉特异启动子的Lat52::GFP 以及 Lat52::GR1-RFP，从后代中筛选 GFP/GFP GR1-RFP/gr1 ntra/- 基因型的植株，筛选呈现绿色的双突变花粉管，发现双突变体的花粉在柱头上的生长确实存在异常；通过互补实验发现互补花粉管较双突变体的花粉管穿过引导组织的能力有明显提升；为寻找与GR1 NTRA存在相关性的基因，取双突变体的花粉进行了RNA-seq分析，发现差异表达基因富集于响应热、氧化胁迫、损伤和茉莉酸等过程，表明GR1 NTRA可能在这些过程中发挥重要功能；进一步地，为了鉴定花粉中NTRA还原的下游TRX（硫氧还蛋白），用酵母双杂交实验筛选了花粉cDNA文库并验证，共鉴定出6个TRX类蛋白；通过Co-IP验证发现，有3个硫氧还蛋白与NTRA互作；分别购买了突变体，观察花粉管的表型，单突变体没有表型，通过杂交发现TRX基因的三突变体的花粉在柱头上的生长也存在异常。以上结果表明GR1 NTRA通过调控下游蛋白的氧化还原状态，从而调控拟南芥花粉管能否穿过柱头和引导组织，该结果部分解析了氧化还原调控花粉管与柱头识别的机制，为将来解决异花授粉花粉管不能穿过花柱或者培育雄性不育株系提供了思路。