WDR82介导Setd1A复合物定位于基因转录起始位点进而调控基因转录的分子机理研究

WDR82, as an important regulatory component of Setd1A/B methyltransferase complexes, plays a crucial role in normal early embryonic development. A defect in WDR82 leads to stunted embryonic development and death. Recently, it was demonstrated that WDR82 interacts with the N terminal of SETD1A and additionally binds to the phosphorylated C-terminal domain of RNA polymerase II, which can recruit the Setd1A methyltransferase complex to transcription start sites of transcribed genes. However, the molecular mechanism of WDR82 how to recruit the Setd1A methyltransferase complex to transcription start sites of transcribed genes is still elusive. Hence, this project plans to get the ternary complex structure of WDR82, SETD1A and phosphorylated C-terminal domain of RNA polymerase II, coupled with molecular biological and biophysical experiments to elaborate the molecular mechanism of WDR82 recruiting Setd1A methyltransferase complex to the transcription start sites through interacting with the N terminal of SETD1A and phosphorylated C-terminal domain of RNA polymerase II. Furthermore, we will illustrate the functional significance of WDR82 involved in regulating of Setd1A complex at transcriptionally active genes. Finally, the information derived from these studies will lay an important foundation for further drug discovery.

WDR82蛋白作为Setd1A/B复合物中重要的调控蛋白在胚胎发育过程中发挥重要作用，其缺失将会导致胚胎发育延迟和胚胎死亡等现象。最新研究表明，WDR82蛋白通过同时识别结合SETD1A蛋白的N端和RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化C端结构域介导Setd1A复合物定位于目的基因的转录起始位点，从而调控基因转录。但WDR82介导这一过程的分子结合机理还不清楚。本项目拟在上述研究基础上，解析WDR82-SETD1A-RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化C端结构域的复合体结构，并结合多种分子生物学、生物物理学手段，从分子水平揭示WDR82同时结合SETD1A蛋白的N端和RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化C端结构域介导Setd1A复合物定位于目的基因转录起始位点的分子机理，阐明WDR82蛋白在Setd1A复合物调控基因转录过程中的重要作用；本项目的顺利实施，将为后续的药物开发提供分子结构和理论基础。

WDR82作为Setd1A复合物的重要调控蛋白在胚胎发育过程中发挥重要作用，其缺失将导致胚胎发育延迟和死亡等现象。前期研究表明，WDR82通过同时识别结合SETD1A和RNA聚合酶Ⅱ存在于此复合物中，并因此相互作用而介导Setd1A复合物定位于目的基因转录起始位点，但WDR82介导这一过程的分子结合机理还未知。.我们系统研究了WDR82识别SETD1A及RNA聚合酶Ⅱ的不同磷酸化修饰CTD多肽的特异性。通过不同晶体生长条件、蛋白酶处理、单克隆FAB筛选、氨基酸定点突变等方法对WDR82识别SETD1A和RNA聚合酶Ⅱ的复合物晶体进行了筛选及研究。为了解析WDR82晶体结构，我们鉴定并获得了WDR82识别PP1RA的复合物并进行了晶体筛选。此外，我们进行了AP-MS质谱实验，分析了WDR82新的潜在结合蛋白。.ITC和Pull down 结果表明，WDR82分别结合 SETD1A aa.60-90片段和PP1RA aa.451-510片段及Ser5-P CTD多肽。WDR82结合Ser5-P CTD受到Ser2-P和Ser7-P磷酸化修饰的影响。Ser2-P阻碍WDR82与Ser5-P位点的结合，但Ser7-P对WDR82结合Ser5-P的影响不明显。此外，SETD1A 能够增强双磷酸化Ser5/7-P CTD多肽与WDR82的结合。通过噬菌体展示技术，我们获得了WDR82的特异识别FAB，并组装了WDR82-FAB复合物，进行了复合物晶体筛选。AP-MS实验不仅检测到了目前已被报道的WDR82相关复合物，如Setd1A/B和PTW/PP1等，同时还鉴定了WDR82新的潜在识别蛋白，例如ZC3H4蛋白及端粒蛋白复合体组分TERF2蛋白等。上述数据为进一步研究WDR82介导Setd1A复合物的生物学功能及拓展WDR82的新生物学功能认识提供了重要的研究基础。