LysM结构蛋白在猪链球菌9型脑膜炎分离株中的分子致病机制

猪链球菌（Streptococcus suis）是猪的重要致病菌，除猪链球菌2型（SS2）外，猪链球菌9型（SS9）也是一个重要致病菌。深入研究SS9毒力因子目前国内外尚未见报道。比较蛋白组学的前期工作表明，SS9 LysM结构肽聚糖结合蛋白（SS9-LysM）是可能的毒力因子。多种细菌存在LysM结构的蛋白，与黏附及致病性相关。通过无痕缺失新技术，拟构建SS9-LysM缺失株，用斑马鱼模型评价缺失株毒力，酵母双杂交筛选SS9-LysM宿主受体，检测SS9-LysM mRNA在小型猪脑组织等各器官的表达水平，同时通过猪血管内皮细胞黏附及黏附抑制实验评价SS9-LysM的黏附作用及其对毒力的影响，从而阐明SS9-LysM的功能，进一步了解SS9致病机制，为防控该类疫病提供理论依据。

猪链球菌是猪的重要致病菌，除猪链球菌2型（SS2）外，猪链球菌9型（SS9）也是一个重要致病菌。目前对猪链球菌毒力研究主要局限于SS2，深入研究SS9毒力因子的报道很少。比较蛋白组学的前期工作表明，SS9 LysM结构肽聚糖结合蛋白（SS9-LysM）是可能的毒力因子。多种细菌存在LysM结构的蛋白，与黏附及致病性相关。比较基因组学发现该蛋白不仅存在于SS9毒力株GZ0565，而且存在于7株SS2毒力株中，进一步提示LysM蛋白可能参与细菌毒力。同源性分析显示SS9-LysM与无乳链球菌的免疫原性表面蛋白Sip具有41.2%的同源性，免疫蛋白组学证实该蛋白可被猪康复血清识别，提示可作为亚单位疫苗候选。制备SS9-LysM重组蛋白兔抗血清，Western Blot证实SS9-LysM位于细菌表面。为深入研究SS9-LysM功能，建立无痕缺失新技术，成功构建SS9-LysM 缺失突变株（ΔSS9-LysM）。与野生株GZ0565相比，ΔSS9-LysM对HEp-2细胞的黏附率下降86.38%（p<0.001）。猪全血存活试验显示，ΔSS9-LysM在猪血中存活率仅为野生株的27.58%（p <0.001），且猪链球菌在猪血中孵育后，该基因显著提高，提示该蛋白促进细菌在血液中存活。斑马鱼毒力实验显示，ΔSS9-LysM对斑马鱼的半数致死量比野生株高9.81倍（p <0.01），但互补株毒力与野生株相当。ΔSS9-LysM在CD1小鼠的血液、脑、肝和脾中的细菌数量显著少于野生株（p < 0.01）。小鼠血液体内转录组分析显示，与感染野生株的小鼠血液相比，感染ΔSS9-LysM的小鼠血液中有65个基因上调，59个基因下调，上调的基因中20%（13/65）编码铁结合蛋白，15.4%（10/65）与氧转运活性和氧结合有关，提示野生株GZ0565可能通过SS9-LysM下调这些基因的表达，有利于细菌从宿主体内获得铁，从而促进SS在宿主中的存活和感染，为SS致病机理提供一种新机制。此外，本课题建立的无痕缺失新技术，不仅解决了猪链球菌缺失难的问题，而且缺失株无抗性基因，具有成为疫苗株的潜能。研究成果获得一项国家发明专利，发表3篇SCI论文。