荚膜多糖在乳房链球菌感染乳腺过程中的作用研究

当前环境性乳腺炎对奶牛产业的危害日益严重。深入了解该类疾病的发病机制是降低其危害的关键。本项目以环境性乳腺炎的代表病原乳房链球菌为研究对象，以其重要致病因子荚膜多糖为突破点，利用本实验室建立的乳腺感染模型及细胞互作模型，探讨荚膜多糖在乳房链球菌感染过程中的作用。项目通过对荚膜多糖合成过程中关键酶透明质酸合成酶基因（hasA）的缺失，构建基因缺失株，系统研究基因缺失对细菌生理生化特性及毒力的影响；研究基因缺失对动物Ｔ细胞亚群分化（Tregs、CD4+/ CD8+、Th1/Th2）及细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10等）表达和分泌的影响；研究组织及体外培养的细胞上的相关受体及其介导的炎症通路中的关键因子（TLR、NF-κB、TNF-α等）的变化。以期从炎症和免疫关系角度阐明荚膜多糖在乳房链球菌致病机制中的重要作用。本项目的开展将为乳房链球菌引起的乳腺炎的防控提供理论依据。

乳房链球菌是一种重要的环境性乳腺炎致病菌，其感染在世界各国都普遍存在。深入了解其致病机理对有效控制该菌引起的乳腺炎有重要的意义。在细菌感染的过程中，病原与宿主存在相互的作用。本项目以荚膜多糖表达乳房链球菌0140J为研究对象，构建了乳房链球菌0140J荚膜缺陷株及基因互补菌株，进行了相关生物学功能的研究及乳房链球菌0140J与靶细胞、模式动物的互作研究。完成了课题申请书的研究内容和考核指标，获得如下成果：.1）通过扩增hasA基因的上下游侧翼序列，利用抗性选择标记缺失载体，成功构建重组质粒pSET4s：hasA，利用同源重组基因敲除方法成功构建了乳房链球菌0140J荚膜缺陷株。在此基础上，构建了hasA基因互补重组质粒( pSET2- hasA )并将其导入乳房链球菌0140J荚膜缺陷株中，成功构建了基因互补菌株并开展了相关生物学特性研究。.2）将荚膜多糖表达乳房链球菌0140J与乳腺上皮细胞共培养，通过Western blotting、凝胶迁徙实验、流式细胞术、荧光定量RT-PCR等技术探讨乳房链球菌0140J对乳腺上皮细胞功能的影响，结果显示，病原与细胞互作后，体现细胞损伤的标志性酶N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶分泌增多，TLR2蛋白的表达上调，核转录因子NF-κB及其下游炎症因子的表达与分泌也明显增高。说明乳房链球菌能引起乳腺上皮细胞的损伤，乳腺上皮细胞在应对感染的过程中TLRs介导的信号通路可能发挥重要的作用。.3）利用本实验室建立的实验性乳腺感染模型（大鼠），将荚膜多糖表达乳房链球菌0140J灌注大鼠乳腺，不同时间点采集血液及乳腺组织；检测组织损伤、调节性T细胞（Tregs）细胞、免疫及炎症因子的变化，结果显示，感染后，TLRs及其介导的炎症通路上的相关炎症因子（TNF-α、iNOS等）表达上调；MDA含量上升，T-AOC活性显著下降，p47phox及p22phox mRNA表达水平也显著上升；血液中Tregs细胞数量上升明显，乳腺组织中IL-2 mRNA表达水平上升而IL-4 mRNA表达水平呈下降趋势。结果表明，乳房链球菌0140J感染能够引起乳腺组织及机体的炎症、免疫反应。.项目的开展达到了从炎症与免疫关系角度阐明荚膜多糖在乳房链球菌致病机理中的重要作用与意义的目的，为防控乳房链球菌这一重要的环境性病原菌引起的乳腺炎提供了理论指导和实验支持。