转录因子bHLH149在硅诱导人参铁毒抗性中的功能研究

Rusty root is a widespread problem, which can reduce ginseng quality and root price. Iron toxicity is an important phenomenon implicated with this rust symptom. Improving tolerance to iron toxicity of Panax ginseng is an important way to prevent rusty root. In our previous study, transcription factor bHLH149 could be involved in regulation of Fe distribution in ginseng plant, and play a key role in silicon-induced tolerance to iron toxicity. But the specific regulation mechanism is unclear. This study plans to analyze iron-toxicity resistance phenotype, iron content, and physiological response of bHLH149-overexpressed and bHLH149-RNA interference (RNAi) transgenic ginseng hairy root for verifying bHLH149 biology function. We will perform yeast two-hybrid system (Y2H) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technology to screen out and verify the proteins interacting with bHLH149. Expression pattern of bHLH149 gene in response to silicon and iron toxicity will be studied by qRT-PCR. All the result will help us to study mechanism of transcription factor bHLH149 involved in silicon-induced tolerance to iron toxicity in Panax ginseng, which will provide guiding significance and molecular basis for strengthening tolerance to iron-toxicity, preventing rusty root, and research on regulation mechanism of bHLH gene in iron-toxicity stress.

红皮病是人参栽培中的根部常见生理病害，严重影响人参种植的经济效益。铁毒是诱发人参红皮病的关键因素，提高铁毒抗性是预防红皮病的重要手段。课题组前期发现硅能提高人参铁毒抗性，通过RNA-Seq等技术发现转录因子bHLH149在该过程中起重要调控作用，但其作用机制尚不清楚。本课题拟通过对bHLH149过表达和沉默表达转基因人参毛状根进行表型鉴定、铁含量和抗性生理指标分析，明确bHLH149基因的生物学功能；利用酵母双杂交（Y2H）体系和双分子荧光互补（BiFC）实验筛选验证bHLH149的互作蛋白；通过qRT-PCR技术分析，研究bHLH149基因响应硅元素及铁毒胁迫的表达模式，解析bHLH149基因在硅诱导人参铁毒抗性中的作用机制。本研究将对增强人参铁毒抗性以及预防铁毒诱导的红皮病具有重要指导意义，同时也为bHLH转录因子参与铁毒胁迫的调控机理研究提供分子基础。

红皮病是人参栽培中的根部常见生理病害，它会降低人参等级，严重影响人参种植的经济效益。铁毒是诱发人参红皮病的关键因素，提高铁毒抗性是预防人参红皮病的重要手段。项目组长期从事铁毒胁迫和缓解机制研究，前期研究发现外源硅能提高人参铁毒抗性，转录因子bHLH149在该过程中起重要调控作用，但其作用机制尚不清楚。本项目在前期研究基础上，主要开展以下内容：（1）克隆获得bHLH149基因，并通过生物信息学软件分析bHLH149基因和蛋白序列结构，获得的bHLH149基因cDNA序列为1160bp，具有639bp的开放阅读框(ORF)，bHLH149基因编码的蛋白序列含有212个氨基酸。该蛋白含有helix loop helix结构域，介导蛋白二聚体形成，并与蛋白结合DNA有关；（2）亚细胞定位技术证实bHLH149定位于细胞核和细胞膜，主要分布于细胞核；（3）qRT-PCR结果显示不同铁浓度对不同组织部位bHLH149基因表达量的影响不同，尤其是加硅条件下，bHLH149基因表达量变化显著，推测bHLH149基因与硅诱导人参铁毒抗性之间存在关联；（4）转基因实验证明bHLH149基因在拟南芥中过量表达能够显著提高转基因植株的铁毒抗性；（5）采用酵母双杂交筛库技术筛选bHLH149转录因子的互作蛋白，初步筛选出21个克隆，挑取克隆摇菌，进行一对一互作验证后，证明bHLH149与蛋白激酶STPK1以及bHLH63等bHLH家族转录因子存在互作关系。研究结果解析了bHLH149在硅诱导人参铁毒抗性中的作用机制，这为进一步揭示bHLH家族转录因子参与人参铁毒胁迫的调控网络提供分子基础。