GSK3β调节Smad3信号通路的分子机制和在肾小管间质纤维化中的作用

纤维化是慢性肾脏病进展的共同通路，小管间质纤维化是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标。我们观察到体内纤维化肾小管细胞高表达GSK3β，进一步预实验发现，在体外小管间质纤维化模型中，抑制GSK3β可降低TGFβ1诱导的细胞FN表达；过表达GSK3β则增强其表达。研究还发现GSK3β调节Smad3磷酸化水平并与其存在于同一个复合体中。为阐明GSK3β是否以及如何通过Smad3直接调节TGFβ1促小管间质纤维化信号通路，本研究拟借助FRET、定点突变、免疫印迹和CHIP等技术从GSK3β是否直接与Smad3结合，GSK3β磷酸化Smad3位点分析以及怎样由此影响TGFβ1/Smad3信号通路活性这三个角度探讨GSK3β调节Smad3的分子机制和在肾脏纤维化中的作用，为GSK3β信号通路和TGFβ1/Smad3信号通路cross-talk的分析及防治肾小管间质纤维化新靶点的筛选提供新依据

糖原合成酶激酶3β（glycogen syntheses kinase 3β，GSK3β）是广泛存在于各种细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，在多种细胞病理生理机制中发挥重要调节作用。我们观察到在以肾脏纤维化为主要病理特征的慢性移植物肾病中， GSK3β 在受损肾小管细胞中显著高表达。肾纤维化是肾脏疾病进展至终末期衰竭的共同病理表现，其中肾小管间质纤维化程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标，因而对其发生发展机制及其防治的研究具有重要意义。目前尚不清楚GSK3β 是否直接调控小管间质纤维化及其可能的机制。我们以标准的体外肾小管间质纤维化模型——TGF-β1 刺激诱导人近端肾小管上皮细胞（human kidney proximal tubular epithelial cell line，HKC）为研究对象，进行了研究，发现GSK3β 特异抑制剂和过表达GSK3β降低细胞基础水平的和TGF-β1 诱导的细胞纤维化蛋白表达，而转染无激酶活性的GSK3β则抑制纤维化蛋白表达。蛋白免疫印记分析显示GSK3β 特异抑制剂抑制TGF-β1 诱导的Smad3的蛋白磷酸化水平，反之，过表达GSK3β促进Smad3磷酸化（不影响其它Smads），由此提示GSK3β通过TGF-β1/ Smad3促进肾小管上皮细胞纤维化蛋白表达。免疫共沉淀和共聚焦免疫荧光分析显示GSK3β和Smad3具有共定位。细胞总蛋白和细胞核蛋白免疫印记分析发现，GSK3β不影响Smad3总蛋白的表达，但是促进TGF-β1诱导的Smad3磷酸化，以及继而发生的Smad3转核，由此促进Smad3下游靶基因纤维化相关蛋白的表达。在此基础上，通过突变并构建相应突变Smad3表达质粒，初步筛选出GSK3β 磷酸化Smad3 的作用位点为T66，进一步证实了GSK3β与TGF-β1/ Smad3信号通路的cross-talk。总之，本研究发现GSK3β通过促进TGF-β1诱导的Smad3磷酸化，以及继而发生的Smad3转核，由此促进TGF-β1 介导的促肾脏小管间质纤维化，为GSK3β 信号通路和TGF-β1/Smad3 信号通路cross-talk 的分析及防治肾脏小管间质纤维化新靶点的筛选提供新的依据。