深海放线菌Streptomyces sp.SCSIO 3406来源的海酮霉素的生物合成研究

Mariketomycins A-D were isolated from the culture broth of the deep sea-derived strain Streptomyces sp. SCSIO 3406. Their structures contain a polyketide moiety and a sesquiterpene moiety. As to the latter, two isoprene units are cyclized to form hexatomic ring,while the other isoprene unit is involved to form an azaheterocycle togather with polyketide moiety. Mariketomycins A-D showed in vitro activity against Gram-negative and -positive bacteria. Therefore, it is necessary to elucidate their biosynthetic pathway. We will: 1) clone the mariketomycins biosynthesis gene cluster from Streptomyces sp. SCSIO 3406; 2) propose a model for biosynthesis of mariketomycins on the basis of bioinformatics analysis;3) make mutant strains via λ-Red recombinant system and conjugal transfer system to eluciate the function of key genes in the mariketomycins gene cluster and geneate new analogues;and 4)characterize key enzymes catalyzing novel chemistry in vitro in the biosynthetic pathway.

我们从深海放线菌Streptomyces sp.SCSIO 3406的发酵产物中首次分离得到海酮霉素A-D。该化合物结构新颖，属聚酮-倍半萜杂合体，其中两个异戊二烯单位环化成六元环，另一个异戊二烯单位与聚酮结构单元环化形成五元含氧杂环。海酮霉素对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有显著抑制活性。本项目将综合运用微生物学、天然产物化学和分子生物学等多门学科专业技能，克隆海酮霉素生物合成基因簇，利用同源重组和接合转移技术构建重要基因的突变株，HPLC检测突变株的发酵产物，解析突变株产生的中间体或海酮霉素结构类似物的化学结构，从而推测相应基因的功能。另外，对基因簇中的关键基因进行体外表达，生化功能测试。综合分析体内基因敲除和体外酶生化功能测试结果，阐明海酮霉素的生物合成机理。本项目还将为海酮霉素类抗生素的研究与开发提供化学实体和物质基础。本项目在合作单位中国科学院南海海洋研究所的协助下完成。

本项目的研究对象深海放线菌Streptomyces sp. SCSIO 3406能产生抗生素海酮霉素A-D和phenaziterpenes A-B。前者结构新颖，两个异戊二烯单位环化成六元环，另一个异戊二烯单位与聚酮结构单元环化形成五元含氧杂环，对革兰氏阳性菌和阴性菌有显著抑制活性。本项目旨在阐明海酮霉素的生物合成机理。 .本项目主要从以下几个方面开展了研究：.（1）优化SCSIO 3406的产孢培养基和发酵培养基。发现：在培养基1条件下，长势快，产孢好；在AM2ab条件下，菌体生长良好，产物种类多且海酮霉素产量较高。.（2）提取基因组DNA，送交公司进行三代测序。测序结果显示：基因组包含7088个蛋白质编码基因、6个rDNA操纵子和64tRNA基因。利用antiSMASH在线软件，推测共有28个合成基因簇。.（3）异戊二烯结构单元的合成有两条途径，甲羟戊酸（MVA）途径和methyl-erythritol-phosphate (MEP)途径。SCSIO 3406基因组中包含MEP途径的全部基因，分散分布；海酮霉素A-D和phenaziterpenes A-B合成所需要的其他基因则集中分布，包括THN合酶，THN单加氧酶，异戊烯基转移酶，转录调控基因等。.（4）本项目构建了基因组文库，从文库中筛选了包含生物合成基因簇的克隆，并试图利用PCR-Targeting和接合转移技术，构建关键基因的突变株。多次优化接合转移，未成功。. 在本项目的资助下，本项目组已经申请专利一项，欲投学术论文一篇，“Genome sequence of Streptomyces niveus SCSIO 3406”；正在撰写学术论文一篇，“Bioinformatics of mariketomycins gene cluster from Streptomyces sp. SCSIO 3406”。下一步继续优化接合转移条件。