基因沉默NMII工程化调节生长锥促进脊髓损伤修复的相关研究

Spinal cord injury is still a difficult medical problem until now.How to enhance the regeneration capacity of neuronal axon is the key point to promote functional recovery after spinal cord injury. Recent studies have showed that microtubule and actin constitute the cytoskeleton of growth cone, and the growth cone plays a guiding role in the growth of axon. Moreover, the growth cone is the mechanical target and signal target in driving axon extension. Among the signal pathways, the RhoA/Rock pathway plays an important role in regulating the cytoskeleton of growth cone. NMII is the main protein placed downstream of RhoA/Rock signalling pathway, and NMII can engineer the cytoskeleton of growth cone to promote axon regeneration. NMII inhibition can mechanically regulate the structure of microtubule and actin and rehabilitate the guiding function of growth cone in axon extension. Consequently, the first objective of this project is to study the connection between activated NMII content and the rate of growth cone collapse after spinal cord injury. The second objective is to verify the effect of gene silencing NMII on promoting axon regeneration in vitro and vivo experiments and evaluate the effect of promoting functional recovery after spinal cord injury in Wistar rats. It is expected that this project can provide intuitionistic evidences in treating spinal cord injury by gene therapy.

脊髓损伤的治疗至今仍是医学界的难题,提高神经元轴突的再生能力是促进脊髓损伤后神经功能恢复的关键。目前研究发现，微管及肌动蛋白作为生长锥的骨架结构,在轴突生长中起着导向作用，生长锥既是促进轴突生长的机械靶点也是调节轴突生长集中的信号靶点,其中RhoA/Rock通路对生长锥骨架结构起着调节作用，NMII作为此通路下游的主要蛋白,在工程化调节生长锥结构促进轴突再生中起着重要作用，抑制NMII可机械性调节微管及肌动蛋白结构，恢复生长锥对轴突延伸的导向作用,从而明显提高轴突再生能力。因此本课题拟探索脊髓损伤后，NMII激活态含量与生长锥塌陷率及轴突凋亡的相关性；同时采用RNAi技术结合第三代慢病毒载体沉默NMII，通过体内外联合实验探索抑制NMII对生长锥骨架结构的工程化调节作用，观察其促进轴突再生及脊髓损伤后功能恢复的情况，为其应用于脊髓损伤修复提供实验证据。

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的治疗至今仍是医学界的难题，提高神经元轴突的再生能力是促进脊髓损伤后神经功能恢复的关键。目前研究发现，微管及肌动蛋白作为生长锥的骨架结构，在轴突生长中起着导向作用，生长锥既是促进轴突生长的机械靶点也是调剂轴突生长集中的信号靶点，其中RhoA/Rock通路对生长锥骨架结构起着调节作用，NMⅡ作为此通路下游的主要蛋白，在工程化调节生长锥结构促进轴突再生起着重要作用，抑制NMⅡ可机械性调节微管及肌动蛋白结构，恢复生长锥对轴突延伸的导向作用，从而明显提高轴突再生能力。因此本课题立足于NMⅡ基因，以RNA干扰（RNAi）技术为基础，结合第三代慢病毒载体，包装制备应用于大鼠脊髓损伤基因治疗的病毒转染系统，并通过体内实验及体外实验对其疗效进行系统的评估。体外培养大鼠神经元，应用慢病毒载体系统将高抑制活性siRNA导入神经元，qRT-PCR及western blot检测siRNA的抑制效率，并利用免疫组化及扫描电镜观察NMⅡ沉默后轴突再生情况及微管和肌动蛋白的结构。体内慢病毒局部注射，qRT-PCR及western blot检测siRNA的抑制效率，并利用免疫组化及western blot技术观察NMⅡ基因沉默对神经元细胞、星形胶质细胞及突触形成的影响，并结合行为学评价（BBB评分）等指标评估脊髓功能的恢复。体外实验证明siRNA能够体外有效沉默NMⅡ基因，NMⅡ基因沉默的神经元表现出更强的生存能力。体内实验结果表明，大鼠脊髓损伤后不同时间点激活态NMⅡ的表达量与生长锥的塌陷具有相关性；siRNA可以体内有效地沉默NMⅡ基因，NMⅡ基因沉默的神经元表现出更强的生存能力及更多的突触形成，而NMⅡ基因沉默的星形胶质细胞并未呈现出更强的瘢痕形成能力。NMⅡ基因敲除组，行为学评价显示出更好的运动功能恢复。本研究为脊髓脊髓损伤的修复提供了新的思路，同时考虑到RNAi技术的临床应用前景及进展，亦为脊髓损伤临床修复策略的发展提供了方向。