Vc混合菌发酵伴生菌活性蛋白基因克隆表达及其对产酸菌作用机制

The effect mechanism of concomitance bacetrial strain of Bacillus megaterium (B.m) on acid-producing strain of Ketogulonicigenium vulgare(K.v) in two-step fermentation of vitamin C (Vc) has been focused highlight by scientists. It has been accepted that the growth of K.v and 2-keto-L-gulonic acid (2-KGA) producing were promoted by some proteins secreted from B.m. However, it is still unclear about the interaction mechanism between the strain of B.m and the strain of K.v. By purifing active protein isolated from the supernatant of the concomitance bacterium such as the strain of B.m culture, the role of active protein with different treatment to the growth and acid producing of K.v will be revealed according to the detection of number of cells, yield of 2-KGA, the experession and the enzymatic activity and of L-sorbose dehydrogenase（SDH）and the oxidoreduction potential (ORP) respectively with cooperating Real-Time PCR into the techniques used in microbiology research for biophysical and biochemical metabolites. The partial function characteristics of the active protein and its promoting the growth and acid-producing of the K.v will be determined. And the results will also provide some clues for further research in the future.

我国首创具自主知识产权的Vc“二步发酵法”第二步混合菌发酵中，伴生菌（大菌）对产酸菌（小菌）作用机制一直是国内外学者研究的热点。研究表明小菌的生长及产酸与大菌分泌的活性蛋白有关，但其作用机制目前仍不甚清楚。本项目拟由大菌中大量提取分离促小菌产酸的活性蛋白，利用微生物生理生化分析与RT-PCR等研究技术与方法，明确大菌活性蛋白在加热处理前后与小菌细胞数量及代谢产物2-KGA生成量、小菌关键酶SDH及其基因表达量变化关系、以及活性蛋白对小菌生理环境氧化还原状态的影响规律。结果将明确大菌活性蛋白的部分功能特性及其促进小菌生长与产酸作用方式;也为进一步深入研究奠定基础。

维生素C“二步发酵法”第二步混合菌发酵中，伴生菌（大菌）对产酸菌（小菌）作用机制一直是国内外学者研究的热点。研究表明小菌的生长及产酸与伴生菌分泌的活性蛋白有关，推测伴生菌产生活性物质可能提供产酸菌生长适宜的生理生态环境，进而促进产酸菌生长，促进产酸代谢过程关键酶L-山梨糖脱氢酶（SDH）活性而提高产酸量。. 项目研究中伴生菌资源：原Vc生产混合菌系中巨大芽孢杆菌B2980（Bacillus megaterium 2980），B2980的诱变株25B（Bacillus megaterium 25B），实验室分离筛选并保藏效果更好的新伴生细菌枯草芽孢杆菌A9（Bacillus subtitlis A9）、短小芽孢杆菌HJ-04（Bacillus pumilus HJ-04），以及真菌粘红酵母Y175（Rhodotorula glutinis Y175）。. 纯培养伴生菌及产酸菌时添加适量抗氧化剂谷胱甘肽，能够促进产酸菌的生长和产酸，并显著的延长伴生菌的稳定期，推迟伴生菌到达衰亡期的时间。提示还原型谷胱甘肽（GSH）在一定程度上提高菌体对活性氧胁迫的抗性。 当添加5 mmol/L稀土元素镧离子分别纯培养伴生菌和产酸菌时，伴生菌的生长受到了强烈的抑制，而产酸菌的生长和产酸都有一定的增强。测定发酵体系中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）及脂肪过氧化程度等生理生化指标，结果表明：伴生菌能够提供有利于产酸菌生长与代谢的生理生态环境，消除发酵过程产生的氧化胁迫，为探讨伴生菌促产酸作用机制提供新的线索。并且A9混菌体系解除氧胁迫能力高于2980混菌体系，部分阐释了伴生菌A9促产酸菌伴生能力优于2980的原因。. 以生物化学分离技术手段，从B2980分离纯活性蛋白，对其进行MALDI-TOF-MS生物质谱鉴定与数据库查询，鉴定结果分别为机械敏感性离子通道和推测具有Fe-S氧化还原酶活性的假定蛋白，但没有得到其相应的基因。分别从B2980诱变株25B以及新伴生菌A9、HJ-04培养上清液中进行活性蛋白分离与纯化，比较其活性蛋白对促产酸菌生长及产酸与其关键酶SDH活性的影响，明确其共性特征关系；即活性蛋白都有促产酸菌产酸及提高关键酶SDH酶活性，但不及伴生菌培养上清液全组分效果好，说明伴生菌活性蛋白对产酸菌的促进作用只是一个方面。