仿“病毒”生殖道基因递送新型载体的构建及其影响宫颈癌发展的基础研究

Cervical cancer is one of the most frequently occurring malignant tumors in women worldwide. High risk HPV is the necessary factor for cervical cancer. Recently our group has found that the expressions of Sirt5 in cervical cancer tissue samples were significantly higher than normal tissue samples, and knock down of the sirt5 in cervical cancer cell line changed the cellular biological characteristics. The down regulated of Sirt5 decreased the expression of HPV16 gene in cervical cancer cells and the proliferation of cancer cells. Cervical cancer is most commonly found on cervix-vagina. The reproductive tract is a potential site for local as well as systemic gene delivery. The cervix vaginal mucus is the main barrier to reproductive tract gene delivery. The design of mucus-penetrating nanoparticles can be aided by following lessons from nature, namely viruses. Inspired by the virus structure and the study of gene-PLGA combined by disulfide bonds, the reproductive tract neutral nanoparticulate gene delivery systems will be fabricated，gene is in the internal, the peptide with high density hydrophilic groups is on the external. Since cervical cancer is a well known reproductive tract local tumor, the reproductive tract neutral nanoparticulate gene delivery systems may provide a therapeutic target for treatment.

宫颈癌是当今严重威胁妇女健康的第二大常见恶性肿瘤。高危人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌发生的明确病因。我们前期研究发现，Sirt5在人宫颈癌中呈高表达，采用siRNA干扰Sirt5信号通路，抑制宫颈癌细胞增殖和细胞内HPV基因表达。宫颈癌好发于宫颈-阴道部,如能通过生殖道递送基因将有利于产生高效低毒的效果，然而宫颈-阴道粘液成为限制基因治疗的主要因素。自然界中，病毒能强力穿透粘液屏障。受病毒亲水性功能蛋白衣壳护送核酸,穿透粘液的电中性纳米核壳结构启发，结合前期研究已将siRNA与PLGA通过二硫键结合的基础,本项目拟构建结合核酸在核内，外壳修饰高密度的功能短肽，桥接亲水性基团，获得电中性纳米“仿生”载体，期望实现基因以“病毒”式策略完成生殖道至癌细胞内的递送。通过生殖道递送策略，明确基因载体调节Sirt5的表达与宫颈癌发展以及病毒感染间的因果关系,为宫颈癌的靶向治疗提供新的干预手段。

宫颈癌仍是当今严重威胁妇女健康的第二大常见恶性肿瘤。通过生殖道传递siRNA沉默SIRT5信号通路，可能是影响宫颈癌发展的突破口。siRNA是生物大分子，构建载体经生殖道转运siRNA到达宫颈肿瘤组织，是高效低毒沉默靶基因的有效途径。在自然界中，病毒为我们提供了理想的siRNA载体结构模型。本项目模仿病毒的结构，构建了化学结合核酸在核内，外壳修饰MMP2酶切除的功能短肽，桥接亲水性基团的电中性纳米载体。围绕基因载体的构建和功能验证，本项目主要开展了两部分的研究。第一部分为采用一步沉淀法构建获得由聚乳酸羟基乙酸（PLGA）、壳寡糖为主要材料，GAPDH siRNA为模型siRNA的电中性纳米粒。该电中性纳米粒粒径范围为90-100nm，电位值为0-5mV，稳定性好，该纳米粒将siRNA和PLGA通过二硫键化学键合，包封率高（~70%）；在还原条件下体外释放游离siRNA持续48h，在高浓度宫颈粘液模拟液中2h渗透率达30%，中、低浓度模拟液可达70~100%；该电中性纳米粒能够被宫颈癌HeLa、CaSki、SiHa、c33a细胞摄取，并显著降低细胞内靶基因的表达。第二部分合成了含PLGA、MMP2酶切除的功能短肽（PP2）、亲水性基团聚乙二醇（PEG）的新型材料PLGA-PP2-PEG。参照第一部分电中性纳米粒的研究，将PLGA-PP2-PEG替代PLGA，同法制备获得了沉默SIRT5的电中性基因纳米粒。该纳米粒粒径约为150nm，电位值在0-1mV，包封率约为70%，电镜下可观察到该纳米粒呈明显的核-壳结构，核部为PLGA，壳部结构为PP2层和PEG层的双层结构；该纳米粒可显著降低宫颈癌HeLa细胞内SIRT5表达，显著降低Hela细胞侵袭和迁移能力。本项目第一部分的研究结果已整理成论文，被Journal of Pharmaceutical Innovation杂志接收。本项目成功构建了穿透宫颈粘液、高效沉默靶基因的电中性基因纳米载体，明确了基因载体调节SIRT5的表达对宫颈癌细胞的行为学改变，为宫颈癌的靶向治疗提供新的干预手段。