从ERK5信号通路探讨消癥活络方抑制肝星状细胞活化机制的研究

Hepatic fibrosis Pathology is result from extracellular matrix accumulation because of Various chronic liver diseases it is belong to collaterals disease theory and correlated to abdominal mass.Hepatic stellate cell ( HSC ) activation of Hepatic fibrosis is the key pathogenesis.The ERK5 signal transduction pathway is an important pathway in activation of HSC ，and inhibition of activation signals in the HSC conduction is important strategy for treating Hepatic fibrosis.This project aims to establish animal model of hepatic fibrosis induced by CCl4 and TGF beta 1 activated HSC cell model, to study on mechanisms of anti-hepatofibrotic effects of xiaozhenghuoluo prescription through immunohistochemistry, ELISA, Western blot and real-time quantitative PCR and other experimental methods, to research on the mechanisms of anti-hepatofibrotic of xiaozhenghuoluo prescription,and to provide molecular theoretical evidence for preventing and treating hepatic fibrosis by therapeutical Principle of xiaozhenghuoluo.It was important scientific significance that from collaterals disease and gene integrating theory to seek characteristic law in chinese medicinal prevention and cure hepatic fibrosis.

由各种慢性肝病致肝纤维化其病理基础是肝细胞外基质异常增多，与中医"久病多瘀" "久病入络"形成微型癥瘕相关，根据肝纤维化的病理改变将其归入"癥积络病"范畴。肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生的病理关键。ERK5 信号转导通路是HSC 活化过程中一条重要的通路，抑制活化信号在HSC 内的传导是治疗肝纤维化的重要策略。本项目拟建立CCl4诱导肝纤维化动物模型和TGF-β1 活化HSC 细胞模型，通过免疫组化、ELISA、Western blot和实时定量PCR等实验方法，从核酸和蛋白两个水平研究消癥活络方抗肝纤维化的作用及其机制，为消癥活络治则防治肝纤维化提供分子理论依据，从络病与蛋白质基因结合理论寻求中医药防治肝纤维化的特征性规律，对指导中医理论的现代研究有一定的科学意义。

本项目按照研究计划基本完成了相关内容，建立了大鼠皮下注射CCl4诱导肝纤维化动物模型和TGF-β1 活化HSC 细胞模型，同时给予消癥活络方及其含药血清进行干预，结果显示，消癥活络方能一定程度减少肝脏胶原纤维沉积，相应改善肝功能。体外实验研究显示：HSC-T6在培养24h时生长速度最快，到48h时达到平台期；在TGF-β1诱导HSC-T6增殖的实验中，5ng/ml的TGF-β1在24h时与其他剂量组之间比较有显著性差异（P<0.05），与正常组相比具有显著性差异（P<0.05），细胞发生明显转分化；在消癥活络方含药血清对HSC-T6增殖影响的实验中，24h时10%浓度的含药血清组与正常组相比有显著性差异（P<0.05），抑制HSC-T6细胞增殖的作用明显。.动物体内实验表明，消癥活络方可抑制HSC I型胶原和III型胶原mRNA和蛋白表达，抑制HSC活化，抑制α-SMA蛋白的表达和HSC增殖。通过肝脏病理学HE染色和Masson染色，判断肝脏纤维化程度以及肝组织结构改变；分别采用免疫组化和Western Blot检测肝组织中α-SMA和TGF-β1蛋白的表达。结果显示消癥活络方高剂量组、中剂量组与秋水仙碱阳性对照组均能明显改善模型大鼠肝组织纤维化程度，减少纤维沉积；抑制大鼠肝脏中α-SMA和TGF-β1蛋白的表达。消癥活络方能够明显改善大鼠肝纤维化程度，其作用机制可能是通过降低TGF-β1的表达，从而抑制肝星状细胞的活化降低ECM的合成实现。