时效调控HGF修饰的干细胞治疗股骨头坏死的实验研究

股骨头坏死（ONFH）是严重的致残性疾病。研究表明，骨髓基质干细胞（BMSCs）移植对ONFH具有一定的修复作用，但存在坏死区血供差不利于BMSCs存活等问题。因而如何改善缺血坏死区微环境以提高BMSCs对ONFH的修复作用是该研究领域亟待解决的问题。有研究显示肝细胞生长因子（HGF）可在缺氧的条件下有效阻止BMSCs调亡、促血管生成及诱导其定向分化，且已证实HGF修饰的BMSCs对心肌缺血有良好的修复作用，但HGF过量表达又存在诱发肉瘤等风险。为有效改善缺血坏死区微环境以促进BMSCs对ONFH的修复，降低风险，本项目拟构建表达HGF的四环素调控重组腺病毒AdTRE-HGF,对BMSCs进行基因修饰，以达到可通过外源性给药有效调控HGF的释放之目的，并进行体内移植实验观察比较其对ONFH的修复效果，为应用BMSCs治疗ONFH建立新途径，提供新思路。

本研究包括四部分内容，即：（1）携带Tet-on系统和HGF基因的重组杆状病毒的构建；（2）兔BMSCs的原代培养、扩增、鉴定及兔ONFH模型的构建；（3）重组杆状病毒转染兔BMSCs并通过Dox调控目的基因的表达；（4）在Dox调控下携带HGF基因的兔BMSCs对坏死股骨头的修复作用。在第一部分中，以F: 5’-AGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’ ；R: 5’-GTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCC-3’为eGFP合成模板；以F: 5’-AGGATCCATGTGGGTGACCAAACTCC-3’ ；R: 5’-GTCTAGACTATGACTGTGGTACCTTATA-3’为HGF合成模板；以pTet-on Advanced为四环素调控系统，成功构建重组杆状病毒Ac-eGFP和Ac-HGF。在第二部分中，通过密度梯度离心法成功分离培养出原代兔BMSCs，通过换液、传代行细胞纯化，倒置相差显微镜下示细胞贴壁生长、形态呈均质梭形，流式细胞仪检测细胞表面分子标记物示CD29（+）、CD34（-），表明所得细胞为骨髓间充质干细胞。在非脱位下以液氮枪冷冻法成功构建兔股骨头缺血性坏死（ONFH）模型，通过大体标本观察、MRI、组织学检查等表明造模法坏死率高、死亡率低，适于后续研究。在第三部分中，以Ac-eGFP转染兔BMSCs，成功实现在Dox调控下eGFP表达量的相应变化，表明搭载Tet-on系统的重组杆状病毒可成功转染兔BMSCs。当以Ac-HGF转染兔BMSCs， Dox诱导浓度为1000ng/ml时，ELISA检测兔BMSCs中HGF表达量达最大值，且目的基因的表达在转染第3天达峰值。在第四部分中，往造好模的兔股骨头、颈区注入携带HGF的BMSCs液体并口服Dox，常规笼养1月后，行股骨头大体观察、影像学检查及组织学检查等均表明通过可调控HGF表达的BMSCs移植修复坏死股骨头效果明显好于其他处理组。综上，本研究通过将携带Tet-on系统的重组杆状病毒Ac-HGF转染兔BMSCs成功获得可通过Dox时效调控HGF表达的BMSCs，将其移植至兔ONFH模型行坏死股骨头的修复取得理想的效果。