罗非鱼皮活性肽阻断光老化中基质金属蛋白酶上调的作用及机理研究

本课题以罗非鱼皮为原料，采用酶解技术和先进分离手段，制备安全、高效的具有阻断光老化形成功能的活性肽。研究主要围绕三个方面进行：（1）制备罗非鱼皮活性肽。采用酶解技术，以提高清除紫外线诱发的各种自由基的能力为目标，制备高生物活性罗非鱼皮水解产物，对其进一步分离、纯化制备活性肽，并进行结构鉴定；（2）评价罗非鱼皮活性肽阻断光老化形成的作用效果。通过细胞培养和动物体内试验，评价活性肽阻断光老化形成过程中基质金属蛋白酶（MMPs）上调的能力，促进前胶原和胶原组织合成和表达的能力以及对皮肤组织形态结构的保护作用。（3）探讨罗非鱼皮活性肽在阻断光老化形成中MMPs上调的相关作用机制及构效关系。研究罗非鱼皮活性肽在抑制光老化形成过程中信号分子级联和相关蛋白表达变化的作用机制，并探讨其构效关系。本研究课题为罗非鱼皮活性肽的制备及其在阻断光老化形成的应用中提供了理论基础和科学依据。

本课题以罗非鱼皮为原料，制备具有阻断光老化形成功能的活性肽。研究主要围绕以下几个方面进行：（1）制备罗非鱼皮活性肽。根据水解度和体外抗氧化活性，筛选水解用酶，利用正交实验优化单酶的水解条件，并优选双酶水解方式。结果显示，中性蛋白酶和碱性蛋白酶依次水解制备的水解液羟自由基清除率和水解度均最高。（2）评价鱼皮活性肽组分的体外抗氧化能力。采用7种不同的体外抗氧化模型，系统的评价了优化后水解液的抗氧化活性。结果表明，活性肽组分对羟自由基、ABTS•及铁离子螯合模型效果较好，而对FRAP值、DPPH•、超氧阴离子和铜离子螯合模型效果不明显。（3）细胞实验评价鱼皮活性肽组分（TSGH-3）的抗光老化作用及机制。评价了不同浓度活性肽对UV照射下HaCaT细胞的增殖、胞内氧化压力及抗氧化酶活等的影响，并进一步检测胞内MMP-1和胶原含量及MMP-1、MMP-3和MMP-9的蛋白表达。细胞在UV照射下，胞内氧化压力显著上升，抗氧化酶活性显著下降，胶原产量显著下降，MMP-1的产量显著上升（p<0.05），相应的MMP-1、MMP-3和MMP-9表达显著上升（p<0.05）。不同剂量的TSGH-3对UV照射下细胞有保护作用，且剂效关系明显。通过对胞内ERK、JNK及p38的磷酸化程度评价了活性肽对UV照射下细胞MAPK通路的影响。结果显示，TSGH-3能够显著的抑制UV照射引起的JNK和p-38的磷酸化（p<0.05），而对ERK影响不显著（p>0.05）。（4）评价鱼皮活性肽组分体内抗氧化和抑制光老化的作用效果。通过半乳糖致衰老和紫外线致皮肤老化两个试验模型，评价了活性肽对衰老过程中血清、皮肤、肝、肾等组织抗氧化系统的保护作用，并进一步研究了对皮肤中脂质、糖胺聚糖及胶原蛋白含量和组织结构的影响。结果表明，鱼皮胶原肽组分对两种衰老模型具有一定的保护作用，提升相关抗氧化酶的酶活，降低MDA含量，提升皮肤脂质和胶原含量，抑制皮肤糖胺聚糖的积累，有效的保护皮肤的组织结构。（5）关键活性肽的制备。以筛选的鱼皮水解液为材料，以抑制羟自由基活性为指标，对组分进行分离纯化，制备了3条关键活性肽，其氨基酸序列和分子量分别为Glu-Gly-Leu（317.33Da），Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr（645.21Da）和Leu-Ser-Gly-Tyr-Gly-Pro（592.26Da）。